本文選題：水蘇堿　切入點：新生大鼠　出處：《山東大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：研究背景及目的:缺氧缺血性腦病(HIE)是各種原因引起的腦組織缺血、缺氧而導致的腦組織損傷,最常見的是新生兒缺氧缺血性腦病。新生兒缺氧缺血性腦病作為各種圍生期窒息引起的部分或完全缺氧、腦血流減少或暫停從而導致胎兒或新生兒腦損傷的一類疾病,是圍產(chǎn)期窒息后常見并發(fā)癥,臨床上常常會表現(xiàn)出兒童智力、行為障礙等神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥,嚴重者甚至可導致新生兒的死亡。迄今為止,關(guān)于新生兒HIE發(fā)病機制尚未完全闡明,目前的研究表明,缺氧缺血性腦損傷(HIBD)的發(fā)生是一個多因素參與介導地綜合性的病理過程。其病理生理可能與能量耗竭、氧自由基、Ca2+過量內(nèi)流、興奮性氨基酸等因素相關(guān),以上因素相互作用,促使腦細胞凋亡,最終導致腦組織結(jié)構(gòu)破壞甚至死亡。復雜的病理生理機制決定了 HIE的治療是一個很復雜的過程,目前尚缺乏特效療法。如何盡早進行正規(guī)的治療和干預就成為大家一直以來研究的熱點。近年來,很多天然產(chǎn)物因具有神經(jīng)保護作用可以改善缺血性腦損傷而成為研究的熱點。本研究主要通過水蘇堿抑制組蛋白去乙�；�(HDAC)活性來探討水蘇堿在改善新生大鼠腦缺氧缺血性損傷(HIBD)方面的作用及其可能的作用機制,從而為臨床HIE的診療提供有效的理論依據(jù)及數(shù)據(jù)參考。研究方法:1、創(chuàng)建動物模型選取7日齡(P7)Sprague-Dawley(SD)大鼠共 112只,體重(12.1-16.5)g,雌雄不拘,參照Rice及改良法等方法制作新生大鼠缺氧缺血性腦損傷(HIBD)模型,隨機分為4組:1)正常對照組(Sham組,n=12);即假手術(shù)組,正常大鼠,僅分離左側(cè)頸總動脈,掛線不結(jié)扎,不進行通混合氣體;2)陰性對照組(Con組,n=20):HIBD大鼠,給予生理鹽水治療;3)低劑量水蘇堿治療組(L組,n=40):HIBD大鼠,給予水蘇堿腹腔內(nèi)注射,5mg/kg/d;4)高劑量水蘇堿治療組(H組,n=40):HIBD大鼠,給予水蘇堿腹腔內(nèi)注射,10mg/kg/d。以上所有組大鼠均給予為期5天的治療。2、留取新生大鼠腦組織標本完成治療方案后12小時(P12)評估每只新生大鼠的體重和溫度,將所有的新生大鼠麻醉(苯巴比妥)后,心內(nèi)灌注后取大腦組織。將獲取的各組大腦組織再隨機分為兩組,其中一組(n=77)冷凍儲存于-70℃液態(tài)氮儲存罐中用于蛋白的評估,另一組(n=35)制作蠟塊以備進行TUNEL染色。3、評估腦組織的相關(guān)指標對留取的所有大鼠腦組織標本進行梗死面積、細胞凋亡、HDAC活性及生化指標等方面進行檢測或評估。具體如下:1)梗死面積的評估:應用2,3,5氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法,切片后應用圖像分析軟件計算梗死面積;2)細胞凋亡的評估:應用TUNEL染色法,凋亡陽性細胞顯色為棕黃色,采用對腦組織的石蠟切片中隨機計算3個高倍鏡視野中TUNEL染色陽性皮層細胞占總皮層細胞百分率的方法(以%表示);3)HDAC活性的檢測:應用比色檢測法,測定405nm處的吸光度,采用與Sham組比較的方法(以%表示);4)乙�；疕3和H4蛋白表達水平的檢測:應用Westernblot法,應用采用與Sham組比較的方法(以%表示);5)超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)等細胞因子的檢測:應用全自動生化分析儀AU5821測定新生大鼠腦組織勻漿上清液中各個指標的表達水平。6)TNF-α、IL-10等細胞因子的檢測:應用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法,測定新生大鼠腦組織勻漿上清液中各個指標的表達水平。4、統(tǒng)計學分析使用SPSS18.0軟件對統(tǒng)計學數(shù)據(jù)進行分析。計量資料以X±S表示,計數(shù)資料以數(shù)值和百分比表示。統(tǒng)計分析采用t檢驗、單因素方差(Oneway ANOVA)分析或LSD post.hoc分析。當p0.05被認為具有顯著性統(tǒng)計學差異。研究結(jié)果:1.水蘇堿對梗死面積的影響Con組大鼠腦組織的梗死面積(224 mm2)明顯高于Sham組的(20 mm2),且差異有統(tǒng)計學意義(P0.01),說明缺氧條件下大鼠腦組織梗死面積明顯增加。水蘇堿治療組腦梗死面積(L組:89 mm2;H組:53 mm2)較Con組大鼠顯著降低(p0.01)。皮質(zhì)下區(qū)域各組梗死面積變化不大,差異無統(tǒng)計學意義(p0.05)。2.水蘇堿對缺氧缺血性腦損傷新生大鼠腦組織細胞凋亡方面的影響Con組大鼠腦組織的細胞凋亡率為23.8%,明顯高于Sham組的3.5%,且差異有統(tǒng)計學意義(p0.01),說明缺氧缺血條件下新生大鼠腦組織細胞凋亡明顯增加。經(jīng)水蘇堿治療組腦細胞凋亡率(L組:11.4%;H組:5.6%)較Con組大鼠顯著降低,差異有統(tǒng)計學意義(p0.01)。3.水蘇堿對HDAC活性的作用水蘇堿可以降低缺氧缺血性腦損傷新生大鼠腦組織中的HDAC酶的活性,且存在劑量依賴性,差異有統(tǒng)計學意義(p0.01)。其中,Con組的HDAC活性約為238%,經(jīng)水蘇堿治療后,L組降至179%,而H組下降更明顯至136%。另外,經(jīng)水蘇堿治療組中乙�；鞍譎3和H4在缺血新生大鼠腦組織中的表達水平明顯增加,差異有統(tǒng)計學意義(p0.01)。4.水蘇堿對腦組織中細胞因子表達水平的影響Con組中HIBD新生大鼠腦組織TNF-α水平(169 pg/100 mg)較sham組(48 pg/100mg)顯著升高,差異有統(tǒng)計意義(p0.01)。然而,經(jīng)水蘇堿治療后TNF-α表達水平明顯降低(L組為98 pg/100 mg,H組為71 pg/100 mg)(p0.01,p0.01)。此外,水蘇堿治療后IL-10的表達水平亦有明顯增加(p0.05,p0.01)。值得一提的是,研究發(fā)現(xiàn)水蘇堿對TNF-α和IL-10表達水平的作用存在劑量依賴性,差異有統(tǒng)計意義(p0.01,p0.01)。5.水蘇堿在氧化應激方面的作用Con組HIBD新生大鼠腦組織中氧化應激指標如SOD、GSH-PX等指標明顯降低,其中Sham組中SOD及GSH-PX的表達水平分別為2.67±0.23 U/100 mg及192.7±8.3 U/100 mg,而Con組中的表達水平分別為0.79±0.12 U/100 mg及96.8±5.9 U/100mg,具有顯著性統(tǒng)計學差異(p0.01,p0.01)。但經(jīng)水蘇堿治療后的表達比Con組顯著增加(p0.01,p0.01),SOD及GSH-PX的表達水平在低劑量組(L組)和高劑量組(H組)分別為1.73±0.19 UU/100mg及130.6士7.2 U/100mg和2.18±0.20 U/100 mg及 169.2±8.1 U/100 mg。結(jié)論:1.缺氧缺血可導致新生大鼠腦組織梗死,而經(jīng)水蘇堿治療后腦梗死體積明顯減少,說明水蘇堿能夠改善腦組織的梗死。2.水蘇堿可以通過降低HIBD新生大鼠腦細胞凋亡率從而改善缺氧缺血導致的腦組織損傷。3.水蘇堿可以降低HIBD大鼠腦組織中的HDAC酶的活性,從而提示水蘇堿可能通過這種方式保護及改善受損的大鼠腦組織。而且進一步研究發(fā)現(xiàn)水蘇堿對HDAC活性的抑制作用存在劑量依賴性。本實驗主要研究從水蘇堿改善HIBD大鼠腦組織中乙�；疕3和H4蛋白的高表達方面來證實其保護受損腦組織的可能發(fā)生機制。4.水蘇堿可以降低HIBD大鼠腦組織損傷導致的細胞因子如TNF-α高表達及提高IL-10的表達,說明水蘇堿在一定程度上可以降低細胞因子對細胞的破壞作用和減少單核-吞噬細胞功能的抑制作用。另外,同上面的抑制HDAC活性一樣,我們發(fā)現(xiàn)其對細胞因子的作用也存在劑量依賴性,充分提示水蘇堿可以保護腦組織減少進一步的損傷。5.水蘇堿可以提高氧化應激反應的相關(guān)指標如SOD、GSH-PX的表達,從而保護腦細胞免受內(nèi)源性超氧化物自由基陰離子的毒害作用,這也可能是水蘇堿改善腦損傷的機制之一。意義本研究證實了水蘇堿在HIBD大鼠中具有的神經(jīng)保護作用,其可以明顯改善腦組織的損傷程度,為臨床HIE的診斷及治療提供了很好的思路及理論依據(jù)。我們進一步研究發(fā)現(xiàn)其神經(jīng)保護作用的機制可能是其具有抑制新生大鼠腦組織中HDAC的活性和降低氧化應激反應及神經(jīng)元炎癥反應的作用。
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【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R742

【參考文獻】

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