本文選題：FGFR3　切入點：軟骨發(fā)育不全(ACH)　出處：《第三軍醫(yī)大學》2015年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：哺乳動物中,骨形成主要有軟骨內(nèi)成骨及膜內(nèi)成骨兩種方式。不同于膜內(nèi)成骨,軟骨內(nèi)成骨是指在即將形成骨的位置形成軟骨雛形,間充質(zhì)細胞聚集并分化為軟骨細胞,隨后軟骨細胞增殖、肥大分化、凋亡,最終被成骨細胞取代形成骨的過程。軟骨內(nèi)成骨是四肢長骨及軀干、短骨及部分不規(guī)則骨的主要骨形成方式,在胚胎發(fā)育、長骨生長、骨折修復過程中發(fā)揮重要作用。目前研究發(fā)現(xiàn),FGF、BMP、PTH、Wnt等較多信號分子參與了對軟骨內(nèi)成骨過程的調(diào)控。成纖維細胞生長因子受體3(FGFR3)屬于受體酪氨酸激酶家族,是軟骨內(nèi)成骨的負性調(diào)控分子。FGFR3功能增強型點突變可導致一系列骨骼異常遺傳病,包括軟骨發(fā)育不全(ACH)、季肋發(fā)育不全(HCH)、致死性發(fā)育不全(TD)等。其中,ACH是人類最常見的侏儒遺傳疾病,以四肢短小,頭顱短圓,前額突出,顏面中部發(fā)育不良為特征。ACH病人生長板結(jié)構(gòu)異常,增殖帶柱狀軟骨細胞排列紊亂,增殖帶和肥大帶縮短,生長板提前閉合。利用基因敲除及基因敲入等技術(shù)發(fā)現(xiàn),小鼠敲除Fgfr3基因(R3KO小鼠)后長骨過度生長、生長板軟骨細胞增殖帶與肥大帶顯著變寬,軟骨細胞增殖活性增加;而Fgfr3G369C點突變小鼠Fgfr3功能增強,小鼠個體明顯變小,頭顱短圓,脛骨等長骨生長板組織形態(tài)結(jié)構(gòu)異常,軟骨細胞的增殖帶短稀,其增殖能力減弱,同時肥大軟骨細胞明顯減少,這些均表明FGFR3是軟骨內(nèi)成骨的負性調(diào)節(jié)分子。目前研究發(fā)現(xiàn),除了FGFR3經(jīng)典下游STAT、ERK等信號通路,其它如IHH、PTHr P、BMP與IGF等信號通路也參與了FGFR3所致軟骨發(fā)育不全的調(diào)控過程。盡管如此,關(guān)于FGFR3功能增強所致的軟骨發(fā)育不全的機制仍然不清楚。哺乳動物中,自噬是一種高度保守的細胞降解代謝途徑。自噬廣泛存在于細胞中,對機體生長發(fā)育、能量代謝、疾病免疫及腫瘤的發(fā)生發(fā)展等具有重要的生物學意義。一般而言,正常生理條件下,細胞自噬保持在一個基礎(chǔ)水平,維持細胞正常穩(wěn)態(tài)環(huán)境,而在生長激素缺乏、饑餓、缺氧、細胞內(nèi)受損細胞器及代謝廢物出現(xiàn)較多堆積等危機情況下,自噬快速上調(diào)維持細胞生存。生長板軟骨細胞由于處于特殊的缺氧環(huán)境中,正常的自噬對于維持軟骨細胞活性,軟骨細胞正常發(fā)育有重要作用。近期研究發(fā)現(xiàn)受損的自噬有可能參與了Sumf1或CTGF/CCN2敲除所致的小鼠軟骨發(fā)育異常,其中,軟骨細胞由于喪失了自噬的保護作用而導致其細胞活性顯著受抑。這些結(jié)果均提示自噬在正常軟骨發(fā)育特別是四肢骨生長板軟骨生成過程中發(fā)揮著重要作用。ach作為人類最為常見的侏儒遺傳疾病,fgfr3功能增強導致軟骨細胞活性受損(增殖受抑,分化延遲,凋亡增加),這些與sumf1或ctgf/ccn2敲除所致的軟骨發(fā)育不全是相似的,提示自噬受抑有可能也參與了fgfr3功能增強所致的軟骨發(fā)育不全。本研究中,我們發(fā)現(xiàn)ach小鼠生長板軟骨細胞中自噬活性降低,利用傳統(tǒng)或可誘導敲除fgfr3后自噬活性增加,并且我們在體外軟骨細胞系中增加fgfr3蛋白水平或fgf-2處理激活下游信號通路后自噬活性受抑,這些提示fgfr3負調(diào)控軟骨細胞自噬活性。我們進一步通過胚胎期骨頭培養(yǎng)系統(tǒng),利用自噬早期及晚期抑制劑(3ma與氯喹)處理胚胎期跖骨及脛骨,發(fā)現(xiàn)自噬受抑后抑制骨頭生長,特別是軟骨生成過程,阿爾新藍染色提示自噬抑制劑處理后骨頭增殖帶及肥大帶顯著縮短。在體外軟骨細胞系中,自噬抑制劑氯喹抑制軟骨細胞的增殖活性及分化,與胚胎期骨頭培養(yǎng)系統(tǒng)結(jié)果一致,說明自噬在正常軟骨發(fā)育中發(fā)揮重要作用。自噬抑制劑對軟骨生成的抑制作用與fgf/fgfr3激活所致軟骨生長受抑類似,且氯喹能夠緩解r3ko小鼠胚胎期跖骨的過度生長,這些均說明自噬受抑有可能是fgf/fgfr3所致軟骨發(fā)育不全的機制之一。哺乳動物中,自噬是一個多環(huán)節(jié)、多步驟的代謝過程,一系列高度保守的atg(autophagy)蛋白參與了這一過程,其中atg12-atg5共價復合物是該過程的核心分子之一,其蛋白的正常表達對于自噬過程的正常進行至關(guān)重要。利用動物及細胞實驗發(fā)現(xiàn),干預atg5的表達(敲除、rnai或過表達)均可顯著影響自噬活性。在本研究中,我們利用ach、r3ko及r3cko:cmv-creert小鼠的原代軟骨細胞發(fā)現(xiàn)fgfr3負調(diào)控atg12-atg5復合物的蛋白水平,體外利用軟骨細胞系也同樣發(fā)現(xiàn)過表達fgfr3或fgf-2處理均可顯著降低該復合物的蛋白水平。進一步我們利用免疫共沉淀等技術(shù)發(fā)現(xiàn)fgfr3與atg12-atg5復合物存在相互作用,且fgfr3通過激酶區(qū)(kd,kinasedomain)與atg5結(jié)合,該相互作用可被fgf-2處理激活下游信號通路后增強。通過免疫組化分析,我們發(fā)現(xiàn)fgfr3與atg5在小鼠生長板軟骨細胞中存在表達譜的重疊,這為兩者在生長板軟骨細胞中發(fā)生相互作用提供了空間上的可能性。我們的實驗結(jié)果顯示fgfr3抑制軟骨細胞自噬活性及atg12-atg5復合物蛋白水平,提示atg12-atg5復合物介導的自噬有可能參與了fgf/fgfr3所致軟骨發(fā)育不全的調(diào)控過程。我們利用慢病毒在軟骨細胞系中rnaiatg5后發(fā)現(xiàn),軟骨細胞中atg12-atg5復合物蛋白水平顯著降低,自噬過程幾乎被完全阻斷,而且軟骨細胞增殖活性及分化能力下降,與fgf/fgfr3所致軟骨發(fā)育不全是相似的。并且,我們通過在fgf/fgfr3信號通路激活導致軟骨細胞增殖活性及分化受抑基礎(chǔ)上過表達atg5,發(fā)現(xiàn)過表達atg5能夠促進軟骨細胞中atg12-atg5復合物的表達及自噬活性,并且能夠部分緩解fgf/fgfr3所致軟骨細胞增殖及分化的受抑。這些數(shù)據(jù)不僅說明了atg12-atg5復合物介導的自噬在軟骨發(fā)育中扮演重要角色,也提示其有可能參與了fgf/fgfr3所致軟骨發(fā)育不全的調(diào)控過程。為了進一步驗證自噬在正常軟骨發(fā)育中的重要作用,我們引進了atg7條件敲除小鼠(atg7flox/flox)。雖然atg7與atg5屬于不同的atg,但是兩者在自噬過程中發(fā)揮著同樣的不可或缺的作用,敲除或降低均會導致嚴重的自噬受抑。為此我們利用col2a-cre轉(zhuǎn)基因小鼠,交配繁殖獲得在軟骨內(nèi)特異性敲除atg7的小鼠。rna水平及蛋白水平提示軟骨細胞中atg7顯著降低,westernblotting發(fā)現(xiàn)突變小鼠自噬活性顯著受抑。通過大體表型及組織學分析,我們發(fā)現(xiàn)軟骨內(nèi)特異性敲除atg7的小鼠四肢不成比例地縮短,同ach類似,近端肢體縮短顯著。突變小鼠生長板軟骨細胞增殖標志基因pcna表達降低,原代軟骨細胞經(jīng)誘導分化后阿爾新藍染色較野生小鼠變淺,這些提示突變小鼠增殖及分化受抑。軟骨內(nèi)敲除atg7導致骨骼生長異常提示自噬在正常軟骨生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用,從動物水平進一步驗證了我們前期細胞及胚胎期骨頭培養(yǎng)的結(jié)論�？偟膩碚f,我們發(fā)現(xiàn)自噬在維持軟骨細胞正常生長發(fā)育中發(fā)揮重要作用,并且atg12-atg5復合物蛋白水平降低介導的自噬受抑可能參與了fgf/fgfr3所致軟骨發(fā)育不全的調(diào)控過程,這可能為軟骨發(fā)育及軟骨發(fā)育不全相關(guān)分子機制提供新的理解,從而有可能為fgfr3介導的軟骨發(fā)育不全提供新的治療策略。主要研究方法:第一部分自噬在fgf/fgfr3所致軟骨發(fā)育不全中的作用1.利用小鼠軟骨細胞檢測fgf/fgfr3對自噬活性的影響1)免疫組化檢測ach小鼠及同窩對照野生小鼠脛骨生長板軟骨細胞中自噬標志物lc3的表達;2)分離ach及同窩對照野生小鼠的原代軟骨細胞,westernblotting檢測內(nèi)源lc3轉(zhuǎn)換率;3)分離r3ko及同窩對照野生小鼠的原代軟骨細胞,westernblotting檢測內(nèi)源lc3轉(zhuǎn)換率;4)分離r3cko:cmv-creert小鼠的原代軟骨細胞,tm處理誘導敲除fgfr3后,westernblotting檢測內(nèi)源lc3轉(zhuǎn)換率;5)分離ach及同窩對照野生小鼠的原代軟骨細胞,血清饑餓并結(jié)合溶酶體蛋白酶抑制劑(e64d+pepsa)處理4小時,免疫熒光檢測lc3punctation;6)分離r3cko:cmv-creert小鼠的原代軟骨細胞,tm處理誘導敲除fgfr3后,血清饑餓并結(jié)合溶酶體蛋白酶抑制劑(e64d+pepsa)處理4小時,免疫熒光檢測lc3punctation。2.體外檢測增加fgfr3表達或fgf-2處理后對自噬活性的調(diào)控1)rcs細胞中,瞬時轉(zhuǎn)染fgfr3,血清饑餓并結(jié)合溶酶體蛋白酶抑制劑(e64d+pepsa)處理4小時,westernblotting檢測內(nèi)源lc3轉(zhuǎn)換率;2)atdc5細胞中,血清饑餓12-14小時后,fgf-2結(jié)合溶酶體蛋白酶抑制劑(e64d+pepsa)處理30min,westernblotting檢測內(nèi)源lc3轉(zhuǎn)換率;3)利用穩(wěn)定表達gfp-lc3的hela細胞系,瞬時轉(zhuǎn)染fgfr3,血清饑餓并結(jié)合溶酶體蛋白酶抑制劑(e64d+pepsa)處理4小時,免疫熒光檢測lc3punctation。4)利用穩(wěn)定表達gfp-lc3的hela細胞系,血清饑餓及fgf-2處理,免疫熒光檢測lc3punctation。3.體外檢測自噬抑制劑對軟骨生成過程的作用1)兩種自噬抑制劑(3ma及氯喹)處理胚胎期野生型小鼠跖骨,利用內(nèi)置彩色數(shù)碼相機spot分別于培養(yǎng)0天、4天、7天對跖骨進行拍照,利用ipp6.0軟件測量跖骨軟骨帶及礦化帶長度,統(tǒng)計分析;2)氯喹與fgf-2處理胚胎期野生型小鼠跖骨及脛骨,利用內(nèi)置彩色數(shù)碼相機spot分別于培養(yǎng)0天、4天對跖骨與脛骨進行拍照,利用ipp6.0軟件測量跖骨軟骨帶及礦化帶長度,統(tǒng)計分析。在培養(yǎng)4天后將骨頭進行固定,制備石蠟切片,阿爾新藍染色分析氯喹及fgf-2對骨頭生長板軟骨細胞增殖分化的影響;3)氯喹處理r3ko小鼠胚胎期跖骨,分析自噬抑制劑對過度生長的r3ko小鼠跖骨生長的影響;4)氯喹處理rcs細胞,分別用細胞計數(shù)及mtt檢測自噬抑制劑對軟骨細胞增殖活性的影響;5)氯喹處理its誘導分化的atdc5細胞,通過定量pcr檢測軟骨分化標志基因及阿爾新藍染色,分析自噬抑制劑對軟骨細胞分化的影響。第二部分fgf/fgfr3負性調(diào)控自噬活性的相關(guān)分子機制1.fgf/fgfr3對atg12-atg5復合物蛋白水平的影響1)分離ach及同窩對照野生小鼠的原代軟骨細胞,westernblotting檢測內(nèi)源atg12-atg5復合物蛋白水平;2)分離r3ko及同窩對照野生小鼠的原代軟骨細胞,westernblotting檢測內(nèi)源atg12-atg5復合物蛋白水平;3)分離r3cko:cmv-creert小鼠的原代軟骨細胞,tm處理誘導敲除fgfr3后,westernblotting檢測內(nèi)源atg12-atg5復合物蛋白水平;4)rcs細胞,瞬時轉(zhuǎn)染不同劑量的fgfr3,westernblotting檢測內(nèi)源atg12-atg5復合物蛋白水平;5)atdc5細胞,fgf-2處理30min,westernblotting檢測內(nèi)源atg12-atg5復合物蛋白水平;6)rcs細胞,瞬時轉(zhuǎn)染不同激活形式的fgfr3(wt、y373c、k650m),westernblotting檢測內(nèi)源atg12-atg5復合物蛋白水平;2.fgfr3與atg5外源相互作用的檢測1)293t細胞,免疫共沉淀檢測fgfr3與atg5外源相互作用(fgfr3共沉淀atg5或atg5共沉淀fgfr3);2)293t細胞,gstpulldown檢測fgfr3與atg5的相互作用;3)293細胞,yfp-pca法檢測fgfr3與atg5的相互作用;4)293t細胞,mapping檢測fgfr3與atg5結(jié)合domain;5)293t細胞,免疫共沉淀檢測fgf-2處理對fgfr3與atg5外源相互作用的影響。3.fgfr3與atg5內(nèi)源相互作用的檢測1)hela細胞,瞬時轉(zhuǎn)染fgfr3,免疫共沉淀檢測外源fgfr3與內(nèi)源atg5的半內(nèi)源相互作用;2)hela細胞,免疫共沉淀檢測內(nèi)源fgfr3與atg5相互作用;3)野生小鼠的原代軟骨細胞,免疫共沉淀檢測fgfr3與atg5內(nèi)源相互作用(atg5共沉淀fgfr3或fgfr3共沉淀atg5);4)免疫組化檢測野生小鼠脛骨生長板fgfr3與atg5表達;5)免疫組化檢測ach、r3ko小鼠脛骨生長板atg5表達。4.檢測atg12-atg5介導的自噬對軟骨增殖活性及分化的作用1)利用慢病毒rnai-atg5,構(gòu)建穩(wěn)定表達rnai-atg5的atdc5細胞系;2)定量pcr檢測rnaiatg5效率;3)westernblotting檢測rnaiatg5效率及對atg12-atg5復合物蛋白水平與自噬活性的影響;4)細胞計數(shù)及mtt檢測rnaiatg5后對軟骨細胞增殖活性的影響;5)定量pcr檢測軟骨分化標志基因及阿爾新藍染色,檢測rnaiatg5對軟骨細胞分化的影響;6)定量pcr檢測正常軟骨細胞分化過程中自噬標志基因(atg5、atg12)表達;7)rcs細胞及atdc5細胞過表達atg5后對atg12-atg5復合物蛋白水平與自噬活性的影響;8)細胞計數(shù)及mtt檢測過表達atg5后對fgfr3功能增強所致軟骨細胞增殖活性受抑的影響;9)定量pcr檢測過表達atg5后對fgfr3功能增強所致軟骨細胞分化標志基因降低的影響;10)定量pcr檢測過表達atg5后對fgf-2激活下游信號致軟骨細胞分化標志基因降低的影響;第三部分軟骨內(nèi)特異性敲除atg7后對軟骨生成的影響及可能的機制研究1.通過atg7flox/flox小鼠與col2a-cre轉(zhuǎn)基因小鼠交配繁殖獲得軟骨內(nèi)特異性敲除atg7的小鼠(atg7flox/flox:col2a-cre)2.檢測軟骨內(nèi)特異性敲除atg7小鼠軟骨細胞中atg7敲除效率1)定量pcr檢測軟骨內(nèi)特異性敲除atg7小鼠的原代軟骨細胞中atg7表達;2)westernblotting檢測軟骨內(nèi)特異性敲除atg7小鼠的原代軟骨細胞中atg7蛋白表達及自噬活性;3.軟骨內(nèi)特異性敲除atg7小鼠表型分析1)x光檢測出生后突變小鼠與同窩野生小鼠大體的差異;2)x光檢測出生后7天、1m、2m齡小鼠脛骨、股骨,并測量長度;3)he染色分析出生后2m小鼠脛骨生長板結(jié)構(gòu);4.探索軟骨內(nèi)敲除atg7致肢體不成比例縮短的可能機制1)免疫組化檢測軟骨內(nèi)敲除atg7后對小鼠脛骨生長板軟骨細胞增殖活性的影響(pcna);2)阿爾新藍染色檢測軟骨內(nèi)敲除atg7后對其原代軟骨細胞分化的影響;3)293t細胞,免疫共沉淀檢測外源atg7與外源fgfr3相互作用;4)rcs細胞,免疫共沉淀檢測內(nèi)源atg7與內(nèi)源fgfr3相互作用;5)小鼠原代軟骨細胞,免疫共沉淀檢測atg7與fgfr3內(nèi)源相互作用;主要研究結(jié)果:第一部分fgf/fgfr3信號通負性調(diào)控自噬活性1.fgfr3信號通路抑制小鼠軟骨細胞自噬活性1)免疫組化檢測ach小鼠及同窩對照野生小鼠脛骨生長板軟骨細胞中自噬標志物lc3的表達,結(jié)果提示ach小鼠生長板軟骨細胞lc3信號彌散,強度降低;2)小鼠原代軟骨細胞,ach較同窩對照野生小鼠內(nèi)源lc3轉(zhuǎn)換率降低;3)小鼠原代軟骨細胞,r3ko較同窩對照野生小鼠內(nèi)源lc3轉(zhuǎn)換率增加;4)r3cko:cmv-creert小鼠原代軟骨細胞中,tm處理誘導敲除fgfr3后內(nèi)源lc3轉(zhuǎn)換率增加;5)分離ach及同窩對照野生小鼠原代軟骨細胞,血清饑餓并結(jié)合溶酶體蛋白酶抑制劑(e64d+pepsa)處理4小時,免疫熒光結(jié)果提示fgfr3功能增強后發(fā)生lc3punctation的細胞顯著減少;6)分離r3cko:cmv-creert小鼠原代軟骨細胞,血清饑餓并結(jié)合溶酶體蛋白酶抑制劑(e64d+pepsa)處理4小時,免疫熒光結(jié)果提示敲除fgfr3后發(fā)生lc3punctation的細胞顯著增加。2.體外增加fgfr3表達或fgf-2處理后抑制細胞自噬活性1)rcs細胞中,瞬時轉(zhuǎn)染fgfr3,血清饑餓并結(jié)合溶酶體蛋白酶抑制劑(e64d+pepsa)處理4小時,westernblotting結(jié)果提示fgfr3抑制內(nèi)源lc3轉(zhuǎn)換率;2)atdc5細胞中,血清饑餓12-14小時后,fgf-2處理結(jié)合溶酶體蛋白酶抑制劑(e64d+pepsa)處理30min,westernblotting結(jié)果提示fgf-2激活信號通路后抑制內(nèi)源lc3轉(zhuǎn)換率;3)利用穩(wěn)定表達gfp-lc3的hela細胞系,瞬時轉(zhuǎn)染fgfr3,血清饑餓并結(jié)合溶酶體蛋白酶抑制劑(e64d+pepsa)處理4小時,免疫熒光結(jié)果提示fgfr3表達增加可抑制lc3punctation。4)利用穩(wěn)定表達gfp-lc3的hela細胞系,血清饑餓及fgf-2處理,免疫熒光結(jié)果提示fgf-2激活下游信號后可抑制lc3punctation。。3.體外檢測自噬抑制劑對軟骨生成過程的作用1)兩種自噬抑制劑(3ma及氯喹)均抑制胚胎期野生型小鼠跖骨生長,特別是軟骨生長;2)氯喹與fgf-2作用類似,抑制胚胎期野生型小鼠跖骨及脛骨的軟骨生長,胚胎期骨頭生長板軟骨細胞增殖帶及肥大帶長度顯著縮短;3)氯喹可緩解r3ko小鼠胚胎期跖骨的過度生長;4)氯喹與fgf-2作用類似,抑制處理rcs軟骨細胞增殖活性;5)氯喹與fgf-2作用類似,抑制atdc5軟骨細胞分化。第二部分fgf/fgfr3負性調(diào)控atg12-atg5復合物蛋白水平,并與該復合物存在相互作用1.fgf/fgfr3降低atg12-atg5復合物蛋白水平1)小鼠原代軟骨細胞,ach小鼠的atg12-atg5復合物蛋白水平較同窩對照顯著降低;2)小鼠原代軟骨細胞,r3ko小鼠的atg12-atg5復合物蛋白水平較同窩對照顯著增加;3)r3cko:cmv-creert小鼠原代軟骨細胞,tm處理誘導敲除fgfr3后,atg12-atg5復合物蛋白水平顯著增加;4)rcs細胞,隨著fgfr3表達劑量的增加,atg12-atg5復合物蛋白水平降低加劇;5)atdc5細胞,fgf-2處理30min顯著降低內(nèi)源atg12-atg5復合物蛋白水平;6)rcs細胞,隨著fgfr3激活程度的提高(wt、y373c、k650m),atg12-atg5復合物蛋白水平降低加劇;2.fgfr3與atg5外源相互作用檢測1)293t細胞,免疫共沉淀結(jié)果提示fgfr3與atg5存在外源相互作用(fgfr3共沉淀atg5或atg5共沉淀fgfr3);2)293t細胞,gstpulldown提示fgfr3與atg5存在相互作用;3)293細胞,yfp-pca法檢測提示fgfr3與atg5存在相互作用;4)293t細胞,mapping檢測提示fgfr3通過激酶區(qū)(kd)與atg5結(jié)合;5)293t細胞,免疫共沉淀結(jié)果提示fgf-2處理增強fgfr3與atg5的相互作用。3.fgfr3與atg5內(nèi)源相互作用檢測1)hela細胞,外源fgfr3能夠免疫共沉淀內(nèi)源atg5;2)hela細胞,內(nèi)源atg5能夠免疫共沉淀內(nèi)源fgfr3;3)小鼠原代軟骨細胞,內(nèi)源atg5能夠免疫共沉淀內(nèi)源fgfr3;4)小鼠原代軟骨細胞,內(nèi)源fgfr3能夠免疫共沉淀內(nèi)源atg5;5)免疫組化檢測結(jié)果提示fgfr3與atg5在野生小鼠脛骨生長板軟骨細胞中的表達位置有重疊;6)免疫組化檢測結(jié)果提示ach小鼠脛骨生長板軟骨細胞中atg5的表達降低,而r3ko小鼠表達增加。4.檢測atg12-atg5介導的自噬對軟骨增殖活性及分化的影響1)利用慢病毒rnai-atg5載體,成功構(gòu)建穩(wěn)定表達rnai-atg5的atdc5細胞系;2)定量pcr結(jié)果提示慢病毒rnaiatg5后atg5表達顯著降低;3)慢病毒rnaiatg5后atg5及atg12-atg5復合物蛋白水平顯著降低,且自噬過程幾乎被完全阻斷;4)細胞計數(shù)及mtt檢測結(jié)果提示慢病毒rnaiatg5后顯著抑制軟骨細胞增殖活性;5)定量pcr檢測軟骨分化標志基因及阿爾新藍染色結(jié)果提示慢病毒rnaiatg5后顯著抑制軟骨細胞分化;6)定量pcr檢測軟骨分化標志基因,結(jié)果提示自噬標志基因(atg5、atg12)隨著atdc5細胞分化的進行而表達增加;7)rcs細胞及atdc5細胞過表達atg5后促進atg12-atg5復合物蛋白表達,提高自噬活性;8)細胞計數(shù)及mtt結(jié)果提示過表達atg5后能部分緩解fgfr3功能增強所致軟骨細胞增殖活性受抑;9)定量pcr檢測過表達atg5后能部分緩解fgfr3功能增強所致軟骨細胞分化標志基因的降低;10)定量pcr檢測過表達atg5后能部分緩解fgf-2激活下游信號致軟骨細胞分化標志基因的降低;第三部分軟骨內(nèi)特異性敲除atg7后骨骼生長異常,四肢骨縮短1.成功獲得軟骨內(nèi)特異性敲除atg7的小鼠;2.軟骨內(nèi)特異性敲除atg7的小鼠原代軟骨細胞中atg7顯著降低;1)軟骨內(nèi)特異性敲除atg7小鼠的原代軟骨細胞中atg7rna水平顯著減低;2)軟骨內(nèi)特異性敲除atg7小鼠的原代軟骨細胞中atg7蛋白水平顯著減低,且自噬過程幾乎被完全阻斷;3.軟骨內(nèi)特異性敲除atg7小鼠表型分析1)大體上,突變小鼠與同窩對照野生小鼠相比無顯著差異;2)7天、1m、2m齡突變小鼠脛骨、股骨較同窩野生對照小鼠縮短;3)與同窩野生對照小鼠相比,2m齡突變小鼠脛骨生長板長度變短,增殖帶縮短顯著;4.軟骨內(nèi)敲除Atg7后軟骨細胞分化、增殖受抑,ATG7與FGFR3可能存在作用1)軟骨內(nèi)敲除Atg7后小鼠脛骨生長板軟骨細胞增殖活性下降(PCNA免疫陽性顆粒減少);2)阿爾新藍染色提示軟骨內(nèi)敲除Atg7后原代軟骨細胞分化受抑;3)293T細胞,免疫共沉淀結(jié)果提示ATG7與FGFR3存在外源相互作用;4)RCS細胞,免疫共沉淀結(jié)果提示ATG7與FGFR3存在內(nèi)源相互作用;5)小鼠的原代軟骨細胞,免疫共沉淀結(jié)果提示ATG7與FGFR3存在內(nèi)源相互作用。主要結(jié)論1.FGF/FGFR3信號通路負性調(diào)控軟骨細胞自噬活性;2.自噬抑制劑通過抑制軟骨增殖活性及分化抑制軟骨生成過程;3.FGF/FGFR3信號通路負調(diào)控ATG12-ATG5復合物蛋白水平;4.FGFR3與ATG12-ATG5復合物存在相互作用,并通過激酶區(qū)與ATG5結(jié)合;5.ATG12-ATG5介導的自噬在軟骨發(fā)育特別是對軟骨細胞增殖、分化有重要作用;6.過表達ATG5可部分緩解FGF/FGFR3所介導的軟骨細胞增殖分化受抑;7.軟骨內(nèi)敲除Atg7后小鼠四肢長骨呈不成比例縮短,近端肢體縮短顯著,這與ACH是相似的。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R681.3

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Nan Su;Min Jin;Lin Chen;;Role of FGF/FGFR signaling in skeletal development and homeostasis: learning from mouse models[J];Bone Research;2014年01期

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本文編號：1606627