本文選題：綠茶　切入點(diǎn)：表沒食子兒茶素沒食子酸酯　出處：《南京醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：第一部分綠茶多酚EGCG增強(qiáng)高脂飲食喂養(yǎng)ApoE缺陷小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性目的:急性冠脈綜合征(Acute coronary syndrome,ACS)是指一系列臨床嚴(yán)重的急性心肌缺血性疾病,主要包括不穩(wěn)定型心絞痛以及急性ST段抬高或非ST段抬高型心肌梗死。目前大量研究資料已證實(shí),急性冠脈綜合征發(fā)病的最主要病理生理基礎(chǔ)是冠狀動(dòng)脈中不穩(wěn)定型動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的破裂,引起冠狀動(dòng)脈內(nèi)急性血栓形成,繼而引起心肌嚴(yán)重的缺血、缺氧。近年來,多項(xiàng)臨床流行病學(xué)研究報(bào)道稱,飲用綠茶可以明顯降低冠心病的發(fā)病率。綠茶的抗動(dòng)脈粥樣硬化作用主要原因是綠茶中含有大量的多酚類化合物,其中含量最多的為兒茶素。綠茶中兒茶素主要成分包括表兒茶素(EC),表兒茶素沒食子酸酯(ECG),表沒食子兒茶素(EGC)和表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)。在這些成分中,以EGCG含量最豐富,活性最強(qiáng),已被證明具有多種藥理學(xué)作用和生物學(xué)特性。我們進(jìn)行本研究主要目的就是為了證實(shí)綠茶多酚EGCG是否能夠增強(qiáng)高脂飲食喂養(yǎng)ApoE缺陷小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性并探討其可能的相關(guān)機(jī)制。方法:30只雄性ApoE缺陷小鼠(6周齡,體重18-20g)被隨機(jī)分為對(duì)照組(n=15)以及EGCG組(n=15)這些小鼠均使用含有21%脂肪以及0.15%膽固醇的高脂飲食喂養(yǎng)。EGCG組以及對(duì)照組分別給予EGCG(10mg/kg)或者同等劑量的0.9%生理鹽水進(jìn)行腹腔注射共16周。隨后麻醉處死小鼠,取小鼠頭臂干動(dòng)脈并予固定石蠟包埋。小鼠頭臂干橫切面進(jìn)行HE染色以及Masson染色分別評(píng)估動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形態(tài)以及膠原含量。此外,使用免疫組織化學(xué)染色的方法分析小鼠斑塊中巨噬細(xì)胞以及平滑肌細(xì)胞成分的比例。蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)用來檢測(cè)斑塊中蛋白表達(dá)水平,明膠酶譜法用來檢測(cè)斑塊中基質(zhì)金屬蛋白酶的活性。最后,我們用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)檢測(cè)小鼠血清炎癥因子單核細(xì)胞趨化因子-1(MCP-1)、白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)以及干擾素-γ(IFN-γ)水平。結(jié)果:高脂飲食喂養(yǎng)16周后,ApoE缺陷小鼠頭臂干動(dòng)脈近端橫切面HE染色可見明顯的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成,提示造模成功。另外,與對(duì)照組相比,EGCG組ApoE缺陷頭臂干動(dòng)脈近端粥樣硬化病變程度明顯減輕。Masson染色結(jié)果提示,EGCG干預(yù)后動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中膠原成分明顯增加。免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)EGCG組斑塊中巨噬細(xì)胞比例明顯降低,而斑塊中平滑肌成分顯著增高。此外,Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)EGCG可以顯著降低ApoE缺陷小鼠斑塊中基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子(EMMPRIN)的表達(dá)。同樣,明膠酶譜法結(jié)果提示EGCG組斑塊中MMP-2和-9活性較對(duì)照組明顯減低。最后,與對(duì)照組相比,EGCG腹腔注射后,ApoE缺陷小鼠血清炎癥因子MCP-1、IL-6、TNF-α以及IFN-γ水平顯著降低。結(jié)論:本研究結(jié)果提示,綠茶多酚EGCG能夠增強(qiáng)高脂飲食喂養(yǎng)ApoE缺陷小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性。此外,EGCG增強(qiáng)斑塊穩(wěn)定性的內(nèi)在機(jī)制可能與其抑制多種炎癥因子、基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子以及機(jī)制金屬蛋白酶表達(dá)有關(guān)。第二部分EGCG通過與67LR相互作用抑制巨噬細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子以及基質(zhì)金屬蛋白酶-9的表達(dá)目的:大量研究資料表明在不穩(wěn)定型動(dòng)脈粥樣硬化破裂過程中,由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌的基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子(EMMPRIN)以及基質(zhì)金屬蛋白酶發(fā)揮著十分關(guān)鍵的作用。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)是綠茶中最主要的多酚類化合物,資料顯示EGCG具有多種藥理學(xué)活性并且能夠?qū)π难馨l(fā)揮保護(hù)性作用。近年來,實(shí)驗(yàn)已證實(shí)相對(duì)分子量為67000的層粘連蛋白受體(67LR)為EGCG主要膜表面受體,EGCG與67LR相互作用后可發(fā)揮多種生物學(xué)效應(yīng)。本研究的主要目的就是為了評(píng)估EGCG是否能夠抑制佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)誘導(dǎo)分化巨噬細(xì)胞 EMMPRIN 以及 MMP-9 的表達(dá),并且探討其可能的相關(guān)機(jī)制。方法:使用不同濃度的EGCG預(yù)處理人單核細(xì)胞THP-1細(xì)胞1小時(shí)后,以佛波酯(PMA,100nmol/L)誘導(dǎo)48小時(shí)使其分化為巨噬細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)中使用小干擾RNA(Small-interfering RNA,siRNA)沉默EMMPRIN基因表達(dá)。實(shí)時(shí)定量熒光PCR(Real-Time PCR)測(cè)定 EMMPRIN 和 MMP-9 mRNA 表達(dá),蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)檢測(cè)EMMPRIN以及MMP-9蛋白表達(dá),使用明膠酶譜法檢測(cè)MMP-9的活性。結(jié)果:研究發(fā)現(xiàn)EGCG(10-50μmol/L)可以明顯抑制巨噬細(xì)胞EMMPRIN以及MMP-9的表達(dá),抑制作用呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系,隨著EGCG濃度的增加,其抑制作用明顯增強(qiáng)。Extracellular signal-regulated kinase 1/2(ERK1/2)、p38 以及c-Jun N-terminal kinase(JNK)信號(hào)通路與EMMPRIN和MMP-9的表達(dá)密切相關(guān),EGCG同樣能夠顯著抑制ERK1/2、p38以及JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活。使用基因沉默的方法下調(diào)巨噬細(xì)胞EMMPRIN表達(dá)可以使MMP-9的表達(dá)以及活性明顯下降,提示在EGCG主要通過抑制巨噬細(xì)胞EMMPRIN合成進(jìn)而抑制MMP-9的表達(dá)。為了進(jìn)一步證明EGCG是否通過67LR相互作用發(fā)揮其抑制EMMPRIN以及MMP-9表達(dá)的作用,我們使用67LR抗體封閉巨噬細(xì)胞表面67LR以阻斷EGCG與67LR的相互作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn)EGCG對(duì)巨噬細(xì)胞EMMPRIN以及MMP-9表達(dá)的抑制作用明顯減弱,同樣67LR抗體阻斷了 EGCG對(duì)于ERK1/2、p38以及JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抑制作用。結(jié)論:我們的研究結(jié)果表明,EGCG可以通過抑制ERK1/2、p38以及JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活進(jìn)而降低巨噬細(xì)胞EMMPRIN和MMP-9表達(dá),這些生物學(xué)效應(yīng)是通過EGCG與67LR相互作用介導(dǎo)的。另外,研究發(fā)現(xiàn)在EGCG抑制MMP-9表達(dá)的過程中,EMMPRIN發(fā)揮著主要作用。以上研究結(jié)果提示綠茶多酚EGCG可能成為一種穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的治療劑。
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【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R54

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本文編號(hào)：1604274