本文選題：肝細(xì)胞肝癌　切入點(diǎn)：miR-92b　出處：《青島大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景:肝細(xì)胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)、最具侵襲性的惡性腫瘤之一,然而引起肝細(xì)胞肝癌的腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制尚未完全明確。盡管目前肝癌診斷的工具和手段取得了長(zhǎng)足的發(fā)展,但僅僅只有三分之一的新診斷的肝癌病人具有治療的價(jià)值并能夠得到有效的治療。為了降低肝細(xì)胞癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率,目前亟需國(guó)內(nèi)外的醫(yī)生和科研工作者深入的研究肝細(xì)胞癌發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)制、通過(guò)不斷的探尋影響腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的新分子進(jìn)一步的探索新的能夠應(yīng)用于肝細(xì)胞癌病人臨床診斷的生物標(biāo)志物和治療靶標(biāo)。非編碼RNA(non-coding RNA)包括微小RNA(micro RNA,mi RNA)和長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lnc RNA),已經(jīng)被證明能夠參與包括HCC在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展。mi RNA是一類高度保守的長(zhǎng)度約為20-25個(gè)核苷酸序列的小RNA,可以通過(guò)和靶基因m RNA的3’非翻譯區(qū)結(jié)合抑制靶m RNA的穩(wěn)定性或者抑制靶基因的翻譯在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)一系列癌基因和抑癌基因的表達(dá)。lnc RNA的長(zhǎng)度要大于200核苷酸序列并且被報(bào)道能夠通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲和遷移等影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展lnc RNA可以通過(guò)直接結(jié)合DNA,RNA或者蛋白質(zhì)在中心法則的各個(gè)層次上影響基因的表達(dá),其中l(wèi)nc RNA和mi RNA的相互作用也是目前國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。本論文主要是研究mi RNA和lnc RNA在HCC腫瘤形成的作用及相關(guān)機(jī)制。方法:本文所用到的組織和血液標(biāo)本均來(lái)自于青島大學(xué)附屬醫(yī)院肝膽胰外科和感染性疾病科,本文所用到的肝細(xì)胞癌細(xì)胞模型來(lái)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞與生化研究所。對(duì)人HCC細(xì)胞株和正常人肝細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。細(xì)胞或者組織總RNA抽提并進(jìn)行相應(yīng)逆轉(zhuǎn)錄后,通過(guò)高通量小RNA測(cè)序技術(shù)和熒光實(shí)時(shí)定量PCR(q RT-PCR)技術(shù)分析mi RNA92b在HCC組織及血漿中的表達(dá)水平。使用q RT-PCR技術(shù)分析長(zhǎng)鏈非編碼RNA DANCR在HCC組織及血漿中的表達(dá)水平。同時(shí)結(jié)合臨床資料分析其與臨床病理的相關(guān)性。我們檢測(cè)了HCC患者血漿中mi R-92b與AFP表達(dá)水平的相關(guān)性。在功能研究方面,我們使用CCK-8實(shí)驗(yàn)來(lái)分析mi R-92b和DANCR對(duì)HCC增殖的影響;使用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)來(lái)分析對(duì)HCC遷移的影響;使用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)來(lái)分析對(duì)HCC侵襲的影響。另外,我們購(gòu)買了含有mi R-92b過(guò)表達(dá)慢病毒、mi R-92b knockdown慢病毒和DANCR knockdown慢病毒以及對(duì)照慢病毒,并對(duì)肝細(xì)胞癌細(xì)胞進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,并從上海中科院購(gòu)買了裸鼠構(gòu)建了肝細(xì)胞癌嵌合小鼠模型,來(lái)分析對(duì)體內(nèi)HCC增殖和轉(zhuǎn)移的影響,通過(guò)計(jì)算體內(nèi)形成的腫瘤瘤徑反應(yīng)HCC在體內(nèi)的增殖情況,通過(guò)對(duì)肺進(jìn)行切片并進(jìn)行HE染色來(lái)分析HCC在體內(nèi)轉(zhuǎn)移的情況。在作用機(jī)制研究方面,使用q RT-PCR和蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)β-catenin下游靶點(diǎn)vimentin,CCND1以及MYC基因的蛋白表達(dá)情況;使用免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HCC細(xì)胞中β-catenin蛋白的定位;使用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)來(lái)驗(yàn)證β-catenin轉(zhuǎn)錄激活作用。最后,我們使用SPSS軟件對(duì)所有的數(shù)據(jù)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,統(tǒng)計(jì)學(xué)差異使用學(xué)生t檢驗(yàn)、卡方檢驗(yàn)以及單因素方差分析來(lái)進(jìn)行。使用Pearson進(jìn)行相關(guān)性分析;使用德隆算法比較計(jì)算兩種曲線下面積的差異。結(jié)果:首先,我們發(fā)現(xiàn)mi R-92b在HCC患者腫瘤組織和血漿中的含量明顯增加(p0.05)。mi R-92b的表達(dá)水平和HCC患者的性別及微血管侵犯密切相關(guān)。在女性HCC患者(p=0.041)以及在脈管轉(zhuǎn)移的HCC患者(p=0.026)中,mi R-92b呈現(xiàn)出較高的表達(dá)水平。HCC患者血漿中mi R-92b含量和AFP含量呈正相關(guān)性(p0.001)。在針對(duì)mi R-92b在HCC中的功能研究方面,我們?cè)诩?xì)胞水平下證明mi R-92b的過(guò)表達(dá)能促進(jìn)HCC細(xì)胞的增殖(p0.001)、侵襲和遷移(p0.05);同時(shí)mi R-92b表達(dá)水平的敲低能夠明顯的抑制HCC細(xì)胞的增殖(p0.01)、侵襲和遷移(p0.05)。mi R-92b穩(wěn)定過(guò)表達(dá)后小鼠的腫瘤瘤徑明顯增大(p0.05)且肺轉(zhuǎn)移率明顯提高,而抑制mi R-92b表達(dá)后與對(duì)照相比小鼠腫瘤瘤徑(p0.01)和肺轉(zhuǎn)移率均有明顯的下降。在機(jī)制研究方面,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明mi R-92b能夠通過(guò)促進(jìn)β-catenin蛋白的入核激活β-catenin信號(hào)通路以及下游一系列的信號(hào)分子。表明mi R-92b可以作為HCC患者臨床診斷和治療的潛在生物標(biāo)記物,具有重要的臨床轉(zhuǎn)化意義。接著,我們針對(duì)HCC患者血漿中DANCR的表達(dá)水平和臨床意義進(jìn)行了分析。研究表明DANCR能夠參與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展,但到目前為止,DANCR在HCC診斷和發(fā)生發(fā)展中的作用仍然是未知的。我們證明DANCR在肝癌患者腫瘤組織和血漿中表達(dá)較其他三組對(duì)照組明顯上調(diào)(p0.001);血漿DANCR和腫瘤組織DANCR之間的含量呈現(xiàn)明顯的正相關(guān)性(p0.001);進(jìn)行肝切除的HCC患者術(shù)后血漿DANCR含量明顯低于術(shù)前(p0.01),提示血漿DANCR可能來(lái)自HCC患者的腫瘤組織。并且相關(guān)性分析表明DANCR在HCC組織中的表達(dá)水平和HCC患者的分化程度(p=0.018)、微血管侵犯(p=0.003)和肝包膜侵犯(p=0.023)程度密切相關(guān)。在血漿中則和微血管侵犯(p=0.017)和肝包膜侵犯(p=0.004)程度密切相關(guān)。因此,在微血管和肝包膜侵犯的HCC患者組織和血漿中DANCR的表達(dá)水平明顯升高。血漿中DANCR水平能夠從健康志愿者以及非HCC患者中分辨出HCC患者,其分辨能力要優(yōu)于目前臨床上常用于HCC臨床診斷的AFP(p=0.026)。同時(shí),血漿中DANCR的表達(dá)水平能夠?qū)CC患者和乙肝肝硬化患者的分辨力較高,其分辨力要顯著的優(yōu)于AFP(p=0.001)。因此,血漿中DANCR水平的檢測(cè)是一種潛在的用于HCC患者診斷的生物學(xué)標(biāo)記物。另外,進(jìn)一步的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究表明,DANCR的下調(diào)能夠明顯抑制β-catenin蛋白的表達(dá)水平進(jìn)而抑制β-catenin信號(hào)通路以及下游效應(yīng)分子。DANCR的敲低能夠明顯抑制HCC細(xì)胞的增殖(p0.01)和轉(zhuǎn)移(p0.05),HCC嵌合小鼠模型實(shí)驗(yàn)表明DANCR的敲低能夠明顯的抑制HCC細(xì)胞在裸鼠中成瘤的瘤徑(p0.01)和肺轉(zhuǎn)移率。綜上所述,我們的研究表明DANCR能夠作為HCC患者的診斷以及HCC疾病發(fā)生發(fā)展的潛在生物標(biāo)志物。討論和結(jié)論:mi R-92b和DANCR在HCC患者腫瘤組織和血漿中明顯上調(diào);mi R-92b能夠在體內(nèi)和體外水平促進(jìn)HCC細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移;mi R-92b能夠激活β-catenin信號(hào)通路;與AFP相比,血漿中DANCR對(duì)于HCC患者具有更高的診斷效能;DANCR的knockdown能明顯抑制HCC細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移�？傮w來(lái)說(shuō),mi RNA和lnc RNA在HCC中發(fā)揮的重要作用已經(jīng)得到了越來(lái)越多中外科學(xué)家的關(guān)注和研究。盡管很多HCC相關(guān)的mi RNA和lnc RNA的功能研究已經(jīng)取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步和發(fā)展,但是目前人們僅僅只是研究清楚了一小部分非編碼RNA的功能和特點(diǎn),絕大部分的mi RNA和lnc RNA仍然需要進(jìn)一步的被發(fā)現(xiàn)和研究。因此,對(duì)于HCC特異表達(dá)的mi RNA和lnc RNA的功能和相關(guān)機(jī)制仍然是急需研究解決的。我們相信越來(lái)越多的mi RNA和lnc RNA相關(guān)的研究能夠?yàn)閷ふ倚碌腍CC腫瘤標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)開(kāi)辟一條嶄新的道路。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R735.7

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本文編號(hào)：1600518