本文選題：ATAD3A突變　切入點：遺傳性痙攣性截癱　出處：《浙江大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景遺傳性痙攣性截癱(hereditary spastic paraplegia,HSP)是在 1883 年由Strumpell作為一種帶有遺傳特征的痙攣性截癱疾病進行首次報道,隨后Lorrain對HSP展開了更加詳細(xì)的分析討論,因此HSP也稱之為家族性痙攣性截癱或Strumpell-Lorrain綜合征。統(tǒng)計研究表明HSP的發(fā)病率約為2-10/100000。臨床上癥狀表現(xiàn)多樣化,不同病人不同表現(xiàn),通常還伴有腦癱,視神經(jīng)損傷,智力障礙等一些神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。大多具有的共同特征包括出現(xiàn)下肢萎縮和痙攣性等臨床表現(xiàn),多數(shù)學(xué)者將其歸于遺傳性共濟失調(diào)范疇,約占后者發(fā)病總數(shù)的1/4。遺傳性痙攣性截癱也是一種遺傳上高度異質(zhì)性的神經(jīng)系統(tǒng)遺傳病,目前已經(jīng)有76個HSP致病基因位點被定位,確定的HSP致病基因也已達(dá)54個。其中最為常見的是Spastin基因突變所致的遺傳性痙攣性截癱4型(spastic paraplegia-4,SPG4),約占常染色體顯性遺傳的40%。近年來,不斷地有一些遺傳研究報道新的致病基因突變,其中Tamar Harel.et al報道了一個多發(fā)性的線粒體內(nèi)膜蛋白ATAD3A(ATPase family AAA-domain containing protein 3A)上的突變 c.1582CT(p.Arg 528 Trp)。結(jié)果顯示該位點可以導(dǎo)致神經(jīng)性疾病綜合征,癥狀包括發(fā)育遲緩,肌肉張力低下,痙攣,視神經(jīng)萎縮,軸突神經(jīng)病以及肥厚型心肌病等。通過全外顯子測序,我們對一個HSP患病家系所有的候選致病突變進行檢測,發(fā)現(xiàn)該家系的兩個患者均攜帶有ATAD3A顯性遺傳雜合突變c.1064 GA(p.G355D),其中35歲的母系患者表現(xiàn)為伴隨軸突神經(jīng)病的HSP癥狀,3.5歲的子系患者表現(xiàn)為運動障礙的腦癱,并且其發(fā)病均始于兒童時期。顯性遺傳突變ATAD3Ac.1064GA(p.G355D)位于負(fù)責(zé)ATP結(jié)合的Walker A結(jié)構(gòu)域。目前,關(guān)于線粒體內(nèi)膜AAA(ATPase associated with diverse cellular activities)蛋白 ATAD3A 的功能尚不明確,已知AAA蛋白是通過形成六聚體環(huán)狀結(jié)構(gòu)發(fā)生作用,ATP酶的催化作用需要底物的配合。而后,體外重組蛋白實驗也證明了這個突變蛋白的ATP酶活性較野生型表現(xiàn)出顯著的降低。為進一步研究ATAD3A c.1064GA(p.G355D)突變的功能特性,我們分別構(gòu)建了野生型ATAD3A和突變型質(zhì)粒,在過表達(dá)細(xì)胞模型中觀察到過度分裂的線粒體形態(tài)以及溶酶體的聚集。同樣,我們對病人來源的成纖維細(xì)胞模型以及多功能干細(xì)胞誘導(dǎo)的神經(jīng)元進行研究分析,也觀察到紊亂的線粒體動態(tài)平衡以及異常的更多溶酶體。在成纖維細(xì)胞模型中發(fā)現(xiàn)病人細(xì)胞處于一種通過抑制mTOR激活造成的類似饑餓狀態(tài),并證明上述這些變化與自噬的上調(diào)相關(guān)。綜上所述,我們得出ATAD3A基因突變可以導(dǎo)致高度異質(zhì)性的包括HSP在內(nèi)的一系列顯性遺傳神經(jīng)系統(tǒng)疾病,并且拓展了線粒體內(nèi)膜蛋白ATAD3A與痙攣疾病之間的潛在關(guān)系。目的1.收集目標(biāo)HSP病人臨床癥狀,通過全外顯子測序找到潛在的致病基因突變。2.在構(gòu)建的ATAD3A過表達(dá)細(xì)胞模型中觀察突變體的異常表型。3.在病人特異來源的成纖維細(xì)胞模型中觀察病人細(xì)胞與正常細(xì)胞的差異。4.由成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)的病人特異來源多功能干細(xì)胞分化的神經(jīng)元細(xì)胞模型中觀察病人細(xì)胞相對于正常細(xì)胞的異常表型。方法1.應(yīng)用臨床觀察和核磁共振技術(shù)對目標(biāo)HSP病人進行臨床癥狀的診斷和判定。2.取病人靜脈血液,提取病人全DNA序列,Illumina HiSeq 2500 sequencing進行全外顯子測序,利用ANNOVAR程序?qū)y序結(jié)果進行分析和篩選,找到潛在致病基因突變。3.生物信息學(xué)方法用軟件Discovery studio 4.5 software(BIOVIA)對野生型和突變體ATAD3A蛋白結(jié)構(gòu)進行了預(yù)測,為進一步的功能研究分析提供線索依據(jù)。4.通過體外重組和純化得到野生型和突變體的ATAD3A蛋白,對其進行ATP酶活性檢測(通過測量磷酸鹽的釋放量來計算ATP酶活性)。5.在體外構(gòu)建過表達(dá)野生型和突變體的ATAD3A質(zhì)粒,并在正常人的成纖維細(xì)胞系統(tǒng)中進行過表達(dá)試驗,通過蛋白免疫印跡反應(yīng)進行蛋白檢測,通過活體的線粒體和溶酶體追蹤以及免疫熒光進行線粒體標(biāo)記染色形態(tài)功能分析。6.利用病人皮膚組織原代培養(yǎng)特異性的成纖維細(xì)胞,通過蛋白免疫印跡反應(yīng)進行蛋白檢測,通過活體的線粒體和溶酶體追蹤以及免疫熒光進行線粒體標(biāo)記染色形態(tài)功能分析。7.體外利用病人成纖維細(xì)胞構(gòu)建特異多功能干細(xì)胞系,通過逆轉(zhuǎn)錄病毒將三種附加體質(zhì)粒包括六種重要因子(OCT3/4,SOX2,KLF4,L-MYC,LIN28和T53 shRNA)整合到細(xì)胞進行重編程。8.通過在不同階段提供營養(yǎng)因子的方法將多功能干細(xì)胞特異誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元。9.在病人特異性的神經(jīng)元中通過蛋白免疫印跡反應(yīng)進行蛋白檢測,通過活體的線粒體和溶酶體追蹤以及免疫熒光進行線粒體標(biāo)記染色形態(tài)功能分析。結(jié)果1.臨床觀察目標(biāo)病人出現(xiàn)明顯的下肢萎縮畸形癥狀,且核磁共振顯示脊髓有萎縮變性的形態(tài)特征。ATAD3A序列進化上高度保守,且我們研究的目的片段在不同的生物種屬和同一蛋白家族之間也都高度保守。2.全外顯子測序?qū)撛诘闹虏』蛲蛔冞M行篩查,雖然在已知的HSP致病基因中未發(fā)現(xiàn)突變,但是發(fā)現(xiàn)家系圖譜顯示第二代母親患者與第三代孩子患者均攜帶有 ATAD3A c.1064GA(p.G355D)突變。3.野生型和突變體ATAD3A蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示了目標(biāo)突變在距離底物結(jié)合部位的γ-磷酸鹽小于4A的位置能夠引入一個正在進入的ATP磷酸負(fù)電荷,這一結(jié)果將很可能導(dǎo)致其對ATP的親和力下降。4.體外重組和純化ATAD3A野生型和突變體目的蛋白,其ATP酶活性實驗結(jié)果顯示W(wǎng)alker A突變蛋白較野生型有顯著的下降趨勢。并且野生型與突變體的混合蛋白表現(xiàn)出同樣程度的ATP酶活性下降,這一結(jié)果表現(xiàn)其負(fù)顯性調(diào)控特性。5.正常人成纖維細(xì)胞中過表達(dá)野生型ATAD3A,以及K358R和G355D的突變體,同時共轉(zhuǎn)染線粒體標(biāo)記的綠色熒光蛋白(mitoGFP),蛋白免疫印跡反應(yīng)結(jié)果證實了過表達(dá)系統(tǒng)的有效性,進而對線粒體過度分裂的細(xì)胞在轉(zhuǎn)染細(xì)胞的百分比進行計數(shù),結(jié)果顯示過表達(dá)突變體組相比于過表達(dá)野生型ATAD3A組存在更多的線粒體過度分裂細(xì)胞。6.在病人皮膚組織原代培養(yǎng)出的成纖維細(xì)胞模型中發(fā)現(xiàn)盡管ATAD3A蛋白的表達(dá)量與正常人無差異,但是在呼吸鏈復(fù)合物亞基II和IV的表達(dá)水平較正常組明顯升高,而Drpl的表達(dá)明顯降低,且觀察到病人細(xì)胞中伴有超極化線粒體。7.對活細(xì)胞進行線粒體(Mito-tracker Red)和溶酶體(Lyso-tracker Green)的追蹤以及電鏡結(jié)果顯示其形態(tài)學(xué)變化,發(fā)現(xiàn)在病人成纖維細(xì)胞中有異常的延長線粒體形態(tài)以及更多的溶酶體空洞。8.驗證誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞系,RT-PCR以及免疫熒光染色結(jié)果顯示iPSC細(xì)胞系中均能夠內(nèi)源表達(dá)OCT4,SSEA4和TRA-1-60等干細(xì)胞表面標(biāo)記物,且RT-PCR證實了 OriP和EBNA1在干細(xì)胞系中不見表達(dá),表明轉(zhuǎn)基因載體已被清除。9.在活細(xì)胞中進行線粒體(Mito-tracker Red)和溶酶體(Lyso-tracker Green)追蹤以及電鏡結(jié)果顯示形態(tài)學(xué)變化,發(fā)現(xiàn)在病人特異性的神經(jīng)元細(xì)胞中有類似成纖維細(xì)胞模型出現(xiàn)的異常線粒體過度分裂形態(tài)以及更多的溶酶體空洞。結(jié)論1.ATAD3A重組的突變體蛋白有表現(xiàn)出顯著的ATP酶活性下降趨勢。2.過表達(dá)細(xì)胞模型中,突變體ATAD3A過表達(dá)表現(xiàn)出明顯的線粒體形態(tài)異常過度分裂,且伴隨有溶酶體堆積及自噬水平的上調(diào)。3.同樣類似的在病人來源的成纖維細(xì)胞和多功能干細(xì)胞特異誘導(dǎo)神經(jīng)元的細(xì)胞模型中,觀察到紊亂的線粒體動態(tài)平衡和更多的溶酶體空洞。4.病人細(xì)胞處于一種類似饑餓的狀態(tài),存在自噬活動增強。ATAD3A顯性負(fù)突變進而能導(dǎo)致高度異質(zhì)性的包括HSP在內(nèi)的一系列多變化的顯性遺傳神經(jīng)系統(tǒng)疾病,并且家系不同成員中可存在顯著差異。
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【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R741

【參考文獻】

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本文編號：1600513