發(fā)布時間：2018-03-09 01:04

  本文選題：CNOT7　切入點：肝癌　出處：《山西醫(yī)科大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的:在我國肝細胞癌是發(fā)病率和致死率均居第四位的惡性腫瘤。肝臟由于各種因素所致的炎癥,引起肝實質細胞的持續(xù)破壞和再生,導致肝炎和肝硬化出現(xiàn),并最終導致肝癌的發(fā)生。慢性炎癥可導致腫瘤的發(fā)生,目前已經得到醫(yī)學界廣泛認可。引起慢性肝臟炎癥的因素包括:各種肝炎病毒如HBV,HCV的感染,酒精濫用,藥物濫用等。其中HBV感染是目前導致我國肝癌發(fā)生的主要因素之一。Ⅱ型干擾素(IFN-γ)作為一種重要的細胞因子參與了機體固有免疫應答和適應性免疫應答,參與了機體抗病毒和抗腫瘤的過程。干擾素包括很多類型,目前已經廣泛被用于病毒所導致肝炎和肝細胞癌的治療。但現(xiàn)有證據表明,主要是IFN-γ參與了機體自發(fā)的抗腫瘤反應,而不是其他類型的干擾素。然而單純增加肝細胞癌患者血中IFN-γ的水平并不能增強抗腫瘤效果。有資料顯示肝癌細胞對IFN-γ具有耐受性。腫瘤對IFN-γ的耐受主要是由于腫瘤細胞內IFN-γ的信號傳遞因子STAT1表達下降所引起,重新導入STAT1基因后可以逆轉這種耐受。CNOT7是CCR4-NOT蛋白復合體的一個重要功能亞基,在某些腫瘤中高表達。有文章證明CNOT7具有調控干擾素的作用,通過控制STAT1本身的轉錄和降解其下游的信號因子從而抑制干擾素的功能。本研究的目的是探討CNOT7基因在HBV所致肝癌的中表達的變化;研究CNOT7基因表達變化與肝癌細胞對IFN-γ耐受的關系;探索CNOT7基因參與肝癌細胞免疫耐受的機制。方法:我們用ELISA法檢測了乙型肝炎肝癌患者和乙型肝炎肝硬化患者外周血中IFN-γ的水平;用免疫組織化檢測了乙型肝炎肝癌組織中CNOT7,STAT1和STAT3的表達。我們用MTT,流式細胞術,檢測四株肝癌細胞系對IFN-γ的耐藥性;用qPCR和western blot檢測了四株肝癌細胞系CNOT7,STAT1和STAT3的表達,并篩選合適的實驗用肝癌細胞株。我們采用CNOT7基因敲除和過表達的方法探索CNOT7和STAT1的關系,并建立穩(wěn)轉細胞株(HepG2sh CNOT7)和(HepG2CNOT7)。我們用MTT,流式細胞術,檢測HepG2~(shCNOT7)對IFN-γ的耐藥性。最后,我們用qPCR和western blot檢測IFN-γ作用于HepG2~(shCNOT7)后STAT1,STAT3,cyclinE1和caspase3的變化。結果:實驗結果提示肝癌患者血液中ifn-γ的水平并未出現(xiàn)明顯下降,提示肝癌的發(fā)生與ifn-γ水平下降關系不密切。而肝癌組織中stat1的表達明顯下調。提示肝癌的發(fā)生可能與腫瘤細胞對ifn-γ的耐受有關。肝癌組織中cnot7表達的上調與stat1表達下調明顯相關,提示高表達cnot7可能是抑制stat1表達的原因之一。stat3是stat家族的另一個重要的細胞因子,在生物反應過程中扮演著與stat1的相反的角色。但實驗中stat3在肝癌的表達與周圍正常組織相比未見明顯升高。該實驗結果出乎我們的意料,也與既往的研究結果不相符,分析實驗結果無誤后,我們推測可能的原因是乙肝肝癌患者體內ifn-γ水平較高,高水平的ifn-γ刺激肝癌細胞stat1表達,從而抑制了stat3的表達。我們選用四種肝癌細胞系檢測對ifn-γ的耐藥性,并篩選合適的實驗用肝癌細胞株。實驗結果提示:這四種細胞的耐藥性與腫瘤cnot7和stat1的表達水平有關。cnot7的表達越高,肝癌細胞的耐藥性越明顯,而stat1的表達則正好相反。實驗結果還提示hepg2是我們下一步實驗用的理想細胞株。我們采用cnot7基因敲除和過表達的方法探索cnot7和stat1的關系。我們對hepg2細胞進行cnot7基因敲除(hepg2shcnot7)和過表達(hepg2cnot7),并建立穩(wěn)轉細胞株。實驗結果顯示:cnot7基因敲除,可促進stat1的蛋白表達上調;cnot7基因過表達,則stat1的蛋白表達受到明顯的抑制。但在整個實驗中stat1mrna的水平并未出現(xiàn)明顯的變化。為進一步探索cnot7和stat1內在作用機制,我們采用免疫共沉淀分析二者間的關系。共沉淀結果提示:cnot7通過與靜息狀態(tài)的stat1蛋白直接結合,抑制stat1的磷酸化入核,抑制stat1的自身循環(huán)。從而負性調控ifn-γ對肝癌細胞的作用。我們用ifn-γ對cnot7基因敲除的hepg2(hepg2shcnot7)穩(wěn)轉細胞株進行干預。檢測其增殖的變化。實驗結果顯示:cnot7基因敲除本身對hepg2的影響并不明顯,但逆轉了肝細胞癌對ifn-γ耐受。hepg2shcnot7在受到ifn-γ的干預后,明顯出現(xiàn)增殖抑制、周期阻滯、凋亡率上升。最后,我們對cnot7基因敲除逆轉肝細胞癌對ifn-γ耐受的機制進行了探索。實驗結果顯示:ifn-γ干預hepg2shcnot7后stat1的表達顯著上調,腫瘤周期調控蛋白cycline1的表達出現(xiàn)明顯下降,發(fā)生周期抑制;caspase3的表達則明顯上升,并出現(xiàn)其功能激活狀態(tài)cleavedcaspase3,腫瘤細胞的凋亡明顯上調。cnot7基因敲除,明顯逆轉了肝癌細胞對ifn-γ的耐受。stat3作為與stat1的功能截然相反的另外一種信號蛋白。我們的實驗結果也證實:肝癌細胞CNOT7基因敲除后,IFN-γ可相對抑制HepG2sh CNOT7細胞中STAT3的表達,抑制了STAT3的促增殖功能�；谖覀兊膶嶒灲Y果,我們證明了STAT1和STAT3之間存在著某種的競爭性抑制關系。IFN-γ對腫瘤細胞的作用主要取決于STAT1/STAT3的比值。當STAT1正常表達時,IFN-γ的功能以激活STAT1為主,表現(xiàn)出抑癌作用;當STAT1缺乏時,IFN-γ的功能可能以激活STAT3為主,表現(xiàn)出促腫瘤生長的作用。結論:我們的實驗證明乙肝肝癌患者腫瘤的發(fā)生歸結于IFN-γ的耐受,而不是IFN-γ的缺乏。IFN-γ的耐受主要與STAT1的下降和CNOT7的上調有關。CNOT7基因敲除可明顯逆轉肝癌細胞對IFN-γ的耐受。CNOT7作為一種IFN-γ的負性調控因子,由于乙肝肝癌患者本身血液中IFN-γ水平并未出現(xiàn)明顯下降,抑制肝癌患者體內CNOT7的表達,應該能夠起到一定抗腫瘤的作用。而本身CNOT7基因敲除對細胞的影響極小,可能預示這這種方法在臨床應用中副作用較小,臨床實用性更強�？紤]到CNOT7基因敲除強大的免疫佐劑效果,這種方法可能為目前已經走入困境的免疫治療提供重要的幫助。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R735.7

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本文編號：1586307