本文選題：CNOT7　切入點(diǎn)：肝癌　出處：《山西醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:在我國肝細(xì)胞癌是發(fā)病率和致死率均居第四位的惡性腫瘤。肝臟由于各種因素所致的炎癥,引起肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的持續(xù)破壞和再生,導(dǎo)致肝炎和肝硬化出現(xiàn),并最終導(dǎo)致肝癌的發(fā)生。慢性炎癥可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生,目前已經(jīng)得到醫(yī)學(xué)界廣泛認(rèn)可。引起慢性肝臟炎癥的因素包括:各種肝炎病毒如HBV,HCV的感染,酒精濫用,藥物濫用等。其中HBV感染是目前導(dǎo)致我國肝癌發(fā)生的主要因素之一。Ⅱ型干擾素(IFN-γ)作為一種重要的細(xì)胞因子參與了機(jī)體固有免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答,參與了機(jī)體抗病毒和抗腫瘤的過程。干擾素包括很多類型,目前已經(jīng)廣泛被用于病毒所導(dǎo)致肝炎和肝細(xì)胞癌的治療。但現(xiàn)有證據(jù)表明,主要是IFN-γ參與了機(jī)體自發(fā)的抗腫瘤反應(yīng),而不是其他類型的干擾素。然而單純?cè)黾痈渭?xì)胞癌患者血中IFN-γ的水平并不能增強(qiáng)抗腫瘤效果。有資料顯示肝癌細(xì)胞對(duì)IFN-γ具有耐受性。腫瘤對(duì)IFN-γ的耐受主要是由于腫瘤細(xì)胞內(nèi)IFN-γ的信號(hào)傳遞因子STAT1表達(dá)下降所引起,重新導(dǎo)入STAT1基因后可以逆轉(zhuǎn)這種耐受。CNOT7是CCR4-NOT蛋白復(fù)合體的一個(gè)重要功能亞基,在某些腫瘤中高表達(dá)。有文章證明CNOT7具有調(diào)控干擾素的作用,通過控制STAT1本身的轉(zhuǎn)錄和降解其下游的信號(hào)因子從而抑制干擾素的功能。本研究的目的是探討CNOT7基因在HBV所致肝癌的中表達(dá)的變化;研究CNOT7基因表達(dá)變化與肝癌細(xì)胞對(duì)IFN-γ耐受的關(guān)系;探索CNOT7基因參與肝癌細(xì)胞免疫耐受的機(jī)制。方法:我們用ELISA法檢測了乙型肝炎肝癌患者和乙型肝炎肝硬化患者外周血中IFN-γ的水平;用免疫組織化檢測了乙型肝炎肝癌組織中CNOT7,STAT1和STAT3的表達(dá)。我們用MTT,流式細(xì)胞術(shù),檢測四株肝癌細(xì)胞系對(duì)IFN-γ的耐藥性;用qPCR和western blot檢測了四株肝癌細(xì)胞系CNOT7,STAT1和STAT3的表達(dá),并篩選合適的實(shí)驗(yàn)用肝癌細(xì)胞株。我們采用CNOT7基因敲除和過表達(dá)的方法探索CNOT7和STAT1的關(guān)系,并建立穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株(HepG2sh CNOT7)和(HepG2CNOT7)。我們用MTT,流式細(xì)胞術(shù),檢測HepG2~(shCNOT7)對(duì)IFN-γ的耐藥性。最后,我們用qPCR和western blot檢測IFN-γ作用于HepG2~(shCNOT7)后STAT1,STAT3,cyclinE1和caspase3的變化。結(jié)果:實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示肝癌患者血液中ifn-γ的水平并未出現(xiàn)明顯下降,提示肝癌的發(fā)生與ifn-γ水平下降關(guān)系不密切。而肝癌組織中stat1的表達(dá)明顯下調(diào)。提示肝癌的發(fā)生可能與腫瘤細(xì)胞對(duì)ifn-γ的耐受有關(guān)。肝癌組織中cnot7表達(dá)的上調(diào)與stat1表達(dá)下調(diào)明顯相關(guān),提示高表達(dá)cnot7可能是抑制stat1表達(dá)的原因之一。stat3是stat家族的另一個(gè)重要的細(xì)胞因子,在生物反應(yīng)過程中扮演著與stat1的相反的角色。但實(shí)驗(yàn)中stat3在肝癌的表達(dá)與周圍正常組織相比未見明顯升高。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果出乎我們的意料,也與既往的研究結(jié)果不相符,分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果無誤后,我們推測可能的原因是乙肝肝癌患者體內(nèi)ifn-γ水平較高,高水平的ifn-γ刺激肝癌細(xì)胞stat1表達(dá),從而抑制了stat3的表達(dá)。我們選用四種肝癌細(xì)胞系檢測對(duì)ifn-γ的耐藥性,并篩選合適的實(shí)驗(yàn)用肝癌細(xì)胞株。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示:這四種細(xì)胞的耐藥性與腫瘤cnot7和stat1的表達(dá)水平有關(guān)。cnot7的表達(dá)越高,肝癌細(xì)胞的耐藥性越明顯,而stat1的表達(dá)則正好相反。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還提示hepg2是我們下一步實(shí)驗(yàn)用的理想細(xì)胞株。我們采用cnot7基因敲除和過表達(dá)的方法探索cnot7和stat1的關(guān)系。我們對(duì)hepg2細(xì)胞進(jìn)行cnot7基因敲除(hepg2shcnot7)和過表達(dá)(hepg2cnot7),并建立穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:cnot7基因敲除,可促進(jìn)stat1的蛋白表達(dá)上調(diào);cnot7基因過表達(dá),則stat1的蛋白表達(dá)受到明顯的抑制。但在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中stat1mrna的水平并未出現(xiàn)明顯的變化。為進(jìn)一步探索cnot7和stat1內(nèi)在作用機(jī)制,我們采用免疫共沉淀分析二者間的關(guān)系。共沉淀結(jié)果提示:cnot7通過與靜息狀態(tài)的stat1蛋白直接結(jié)合,抑制stat1的磷酸化入核,抑制stat1的自身循環(huán)。從而負(fù)性調(diào)控ifn-γ對(duì)肝癌細(xì)胞的作用。我們用ifn-γ對(duì)cnot7基因敲除的hepg2(hepg2shcnot7)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株進(jìn)行干預(yù)。檢測其增殖的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:cnot7基因敲除本身對(duì)hepg2的影響并不明顯,但逆轉(zhuǎn)了肝細(xì)胞癌對(duì)ifn-γ耐受。hepg2shcnot7在受到ifn-γ的干預(yù)后,明顯出現(xiàn)增殖抑制、周期阻滯、凋亡率上升。最后,我們對(duì)cnot7基因敲除逆轉(zhuǎn)肝細(xì)胞癌對(duì)ifn-γ耐受的機(jī)制進(jìn)行了探索。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:ifn-γ干預(yù)hepg2shcnot7后stat1的表達(dá)顯著上調(diào),腫瘤周期調(diào)控蛋白cycline1的表達(dá)出現(xiàn)明顯下降,發(fā)生周期抑制;caspase3的表達(dá)則明顯上升,并出現(xiàn)其功能激活狀態(tài)cleavedcaspase3,腫瘤細(xì)胞的凋亡明顯上調(diào)。cnot7基因敲除,明顯逆轉(zhuǎn)了肝癌細(xì)胞對(duì)ifn-γ的耐受。stat3作為與stat1的功能截然相反的另外一種信號(hào)蛋白。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí):肝癌細(xì)胞CNOT7基因敲除后,IFN-γ可相對(duì)抑制HepG2sh CNOT7細(xì)胞中STAT3的表達(dá),抑制了STAT3的促增殖功能�；谖覀兊膶�(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們證明了STAT1和STAT3之間存在著某種的競爭性抑制關(guān)系。IFN-γ對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用主要取決于STAT1/STAT3的比值。當(dāng)STAT1正常表達(dá)時(shí),IFN-γ的功能以激活STAT1為主,表現(xiàn)出抑癌作用;當(dāng)STAT1缺乏時(shí),IFN-γ的功能可能以激活STAT3為主,表現(xiàn)出促腫瘤生長的作用。結(jié)論:我們的實(shí)驗(yàn)證明乙肝肝癌患者腫瘤的發(fā)生歸結(jié)于IFN-γ的耐受,而不是IFN-γ的缺乏。IFN-γ的耐受主要與STAT1的下降和CNOT7的上調(diào)有關(guān)。CNOT7基因敲除可明顯逆轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞對(duì)IFN-γ的耐受。CNOT7作為一種IFN-γ的負(fù)性調(diào)控因子,由于乙肝肝癌患者本身血液中IFN-γ水平并未出現(xiàn)明顯下降,抑制肝癌患者體內(nèi)CNOT7的表達(dá),應(yīng)該能夠起到一定抗腫瘤的作用。而本身CNOT7基因敲除對(duì)細(xì)胞的影響極小,可能預(yù)示這這種方法在臨床應(yīng)用中副作用較小,臨床實(shí)用性更強(qiáng)�？紤]到CNOT7基因敲除強(qiáng)大的免疫佐劑效果,這種方法可能為目前已經(jīng)走入困境的免疫治療提供重要的幫助。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R735.7

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本文編號(hào)：1586307