發(fā)布時間：2018-03-08 08:39

  本文選題：SLC33A1/AT-1　切入點：骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)　出處：《山東大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：SLC33A1(solute carrier family 33,member1)又稱乙酰輔酶 A 轉運體(Acety1-Coenzyme A transporter 1,AT-1),是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的含有 549 個氨基酸的多次跨膜蛋白,其主要功能是將細胞質(zhì)中的乙酰輔酶A轉運至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中,為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白的乙酰化修飾提供原料。2008年我們實驗室用連鎖分析的方法將青島—常染色體顯性遺傳性痙攣性截癱(hereditary spastic paraplegia,HSP)家系的致病位點定位于該基因所在區(qū)域,并將該HSP位點命名為SPG42(MIM#612539)。其后通過全基因組外顯子測序發(fā)現(xiàn)該家系患者患病是由 SLC33A1 p.Ser113Arg(S113R)(c.339TG)(MIM#603690.0001)錯義突變導致的。借助動物模型,可以從體內(nèi)整體水平研究疾病的發(fā)生、發(fā)展規(guī)律,為疾病的預防和治療提供理論依據(jù),有助于人們發(fā)掘新的治療藥物和治療手段。小鼠基因組與人類基因組同源性極高,小鼠模型被廣泛用于研究人類基因的功能以及基因突變與疾病的關系。因此,本實驗室于2013年構建了S1c33a1s113R基因敲入小鼠模型。對該轉基因小鼠胚胎進行基因型分析發(fā)現(xiàn),純合突變小鼠(S1c33a1mut mut胚胎早期致死,雜合突變(S1c33a1wt/mut)小鼠能存活。為了進一步明確S1c33alS113R突變的致病機制,該論文中我們分析了S1c33a1S113R突變對S1c33a1wt/mut小鼠神經(jīng)系統(tǒng)的影響及其作用機制,并利用坐骨神經(jīng)損傷模型和背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion,DRG)體外培養(yǎng)體系在體內(nèi)和體外兩個水平對S1c33a1wt/mut小鼠的外周神經(jīng)損傷修復能力及其機制進行了研究,研究內(nèi)容及結果分為以下四個部分:第一部分S1c33a1wt/mut小鼠表現(xiàn)出遺傳性痙攣性截癱表型遺傳性痙攣性截癱是一類具有高度遺傳和臨床異質(zhì)性的神經(jīng)退行性或發(fā)育性疾病,以雙下肢無力和肌痙攣為主要臨床表現(xiàn),以雙側皮質(zhì)脊髓束遠端軸突變性和脫髓鞘為常見病理改變。鑒于人類SPG42患者發(fā)病年齡晚,我們重點評估了老齡小鼠的運動功能和神經(jīng)系統(tǒng)表型。我們首先用后肢抱握反射實驗粗略評估了 8-24個月齡小鼠的下肢運動功能,結果顯示,8-24個月齡S1c33a1wt/mut小鼠的后肢抱握反射與同齡WT小鼠相比無明顯差異。但是,利用轉棒實驗和運動耐量試驗進行分析,我們發(fā)現(xiàn)12個月齡的S1c33a1wt/mut小鼠與同齡WT小鼠相比,出現(xiàn)明顯的運動協(xié)調(diào)能力和抗疲勞耐受能力下降。接著,我們對12個月齡小鼠的脊髓進行了組織學分析(包括組織免疫熒光染色、甲苯胺藍染色、勒克司堅牢藍染色和透射電鏡檢查),結果發(fā)現(xiàn),S1c33a1wt/mut小鼠腰段脊髓皮質(zhì)脊髓束中出現(xiàn)明顯的退行性改變,表現(xiàn)為軸突密度減低、髓鞘變性和軸突形態(tài)異常等。另外,透射電鏡結果顯示,S1c33a1wt/mut小鼠腰段脊髓灰質(zhì)區(qū)膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元呈現(xiàn)顯著的退行性改變,包括線粒體腫脹及嵴缺失、游離核糖體增多、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)異常、核袋形成和高爾基體腫脹等異常表型。最后,我們對12個月齡小鼠的坐骨神經(jīng)進行組織學分析,結果未發(fā)現(xiàn)S1c33a1wt/mut小鼠的坐骨神經(jīng)存在明顯異常,對S1c33a1wt/mut小鼠的腓腸肌進行病理學分析也未檢測到明顯異常,這提示S1c33a1wt/mut小鼠的外周神經(jīng)系統(tǒng)尚無顯著異常。另外,盡管以往的報道提示SLC33A1突變可以導致白內(nèi)障、耳聾和銅代謝異常,我們針對這些表型進行檢測和觀察,結果未檢測到S1c33a1wt/mut小鼠存在血漿銅藍蛋白活性異常和白內(nèi)障及耳聾等異常表型�？梢�,S1c33a1wt/mut小鼠存在單純型HSP的相關表型,即運動功能異常和中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性改變,而外周神經(jīng)系統(tǒng)無明顯異常。這與人類SPG42患者的表型是類似的。因此,該模型可以做為探索HSP發(fā)病機制和治療方法的實驗動物模型。第二部分S1c33a1wt/mut小鼠神經(jīng)系統(tǒng)BMP信號通路分析之前報道的至少有5個SPG基因編碼蛋白能調(diào)控BMP信號通路,包括atlastin-1(SPG3A)、spastin(SPG4)、NIPAl(SPG6)、spartin(SPG20)和 PNPLA6(SPG39),因此,BMP信號通路異常被認為是HSP的發(fā)病機制之一。之前我們實驗室用斑馬魚和人皮膚成纖維細胞對SLC33A1功能進行研究的結果顯示:SLC33A1是BMP信號通路的負調(diào)控因子,在敲低Slc33a1的斑馬魚中或發(fā)生SLC33A1S113R突變的人皮膚成纖維細胞中均存在BMP信號通路增強的現(xiàn)象,這提示SLC33A1S113R突變導致SPG42的機制可能是通過影響B(tài)MP信號通路。為了檢測SLC33A1S113R突變在鼠類中是否會影響B(tài)MP信號通路,我們首先用Western blotting方法分析了 12個月齡小鼠脊髓中BMPRlA的水平,結果發(fā)現(xiàn)S1c33a1wt/mut小鼠脊髓中BMPRlA的水平顯著高于WT小鼠。由于之前多項研究表明當神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生損傷病變時,BMP信號通路會上調(diào),所以為了排除S1c33a1wt/mut小鼠中BMPRlA上調(diào)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生退行性改變的后果,我們又檢測了尚未發(fā)生退行性改變的新生鼠以及3個月齡小鼠中BMPRlA的表達情況,結果發(fā)現(xiàn)S1c33a1wt/mut新生鼠脊髓中BMPRlA的水平也顯著高于同齡WT小鼠,這說明S1c33a1wt/mut小鼠脊髓中BMPRlA水平改變不是神經(jīng)退行性改變的后果,而是由于S1c33a1基因突變所致。盡管在體內(nèi)水平,我們無法用Western blotting方法檢測到小鼠脊髓中pSmad1/5/8的表達變化,但在分離培養(yǎng)的小鼠胚胎成纖維細胞(Mouse embryonic fibroblasts,MEF)和原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元中,S1c33a1wt/mutMEF和皮層神經(jīng)元中BMPRlA以及BMP信號下游效應分子pSmad1/5/8的水平在S1c33a1wt/mut小鼠均有升高。這說明在細胞水平,Slc33a1S113R突變就足以對BMP信號通路造成影響。此外,我們還檢測到S1c33a1wt/mut小鼠大腦、小腦和脊髓中BMPR2的表達水平顯著高于WT小鼠,而S1c33a1wt/mut中BMPR2的水平與野生型MEF無明顯改變,這提示BMPRlA升高是S1c33a1S113R突變對細胞的固有影響,而BMPR2升高可能是機體在整體水平協(xié)調(diào)作用的結果。第三部分S1c33a1S113R通過BMP信號通路影響小鼠坐骨神經(jīng)損傷修復速度研究表明BMP信號通路在神經(jīng)系統(tǒng)的再生中發(fā)揮作用,因此我們推測,SLC33A1突變導致的BMP信號通路上調(diào)可能會影響外周神經(jīng)再生修復。為驗證以上假設,我們首先用小鼠坐骨神經(jīng)損傷模型在體內(nèi)水平研究了S1c33a1S113R雜合突變對外周神經(jīng)系統(tǒng)損傷后再生修復的影響。我們從計算坐骨神經(jīng)功能指數(shù)(SFI)和組織學分析兩個方面評價了小鼠的坐骨神經(jīng)損傷后修復速度。SFI結果顯示:與WT小鼠相比,S1c33a1wt/mut小鼠的坐骨神經(jīng)損傷后功能恢復速度明顯加快。組織學分析結果顯示:S1c33a1wt/mut小鼠和WT小鼠損傷側坐骨神經(jīng)中均有細小的軸突及薄髓鞘再生,但是S1c33a1wt/mut小鼠中有髓軸突數(shù)目比WT小鼠明顯增多。這些結果均提示S1c33a1wt/mut小鼠坐骨神經(jīng)損傷后修復速度加快。接著,我們分析了S1c33a1wt/mut小鼠坐骨神經(jīng)損傷后再生修復速度加快與BMP信號通路的關系。我們首先檢測到S1c33a1wt/mut小鼠坐骨神經(jīng)中BMPR1A的水平比WT小鼠高,并且在坐骨神經(jīng)損傷后會進一步增高。除此之外,WT小鼠坐骨神經(jīng)損傷兩天后,SLC33A1的表達水平在損傷的坐骨神經(jīng)中顯著下降,這與SLC33A1是BMP信號通路的負調(diào)控因子相對應。最后,為了進一步驗證BMP信號通路改變是S1c33a1wt/mut小鼠坐骨神經(jīng)損傷修復加快的重要因素,我們用BMP信號通路的內(nèi)源性拮抗劑Noggin做了拯救實驗,即對小鼠坐骨神經(jīng)進行鉗夾損傷前,向欲損傷部位近端的神經(jīng)鞘膜內(nèi)顯微注射Noggin,兩天后,用組織免疫熒光染色和針刺實驗兩種方法評價坐骨神經(jīng)損傷后的修復情況。結果顯示,外源性應用BMP拮抗劑Noggin能逆轉S1c33a1wt/mut小鼠坐骨神經(jīng)再生和功能恢復速度加快的現(xiàn)象。這說明至少在一定程度上,S1c33a1突變所引起的S1c33a1wt/mut小鼠外周神經(jīng)損傷修復速度加快是通過BMP信號通路介導的。第四部分S1c33a1S113R通過BMP信號通路影響體外培養(yǎng)DRG神經(jīng)元的軸突生長背根神經(jīng)節(jié)(DRG)再生系統(tǒng)被廣泛用于研究感覺神經(jīng)元的軸突再生,分離培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元可以從單細胞水平評估神經(jīng)元的軸突生長情況,而DRG外植體保持了神經(jīng)元和其周圍非神經(jīng)元細胞之間的聯(lián)系。有研究表明BMP信號通路可以增強DRG神經(jīng)元的軸突再生潛能。在此我們研究了S1c33a1S113R雜合突變是否會通過影響B(tài)MP信號通路影響感覺神經(jīng)元的軸突再生。我們首先對比分析了S1c33a1wt/mut DRG與野生型DRG中BMP信號通路相關蛋白的表達水平。細胞免疫熒光分析結果顯示S1c33a1wt/mut DRG神經(jīng)元中BMPR1A和pSmad1/5/8的水平高于野生型DRG神經(jīng)元。接著,我們用DRG體外培養(yǎng)體系在體外水平研究了Slc33a1S113R雜合突變對外周感覺神經(jīng)元軸突再生情況的影響。實驗結果顯示,培養(yǎng)48小時后,S1c33a1wt/mut DRG外植體和S1c33a1wt/mut DRG離散神經(jīng)元的軸突長度均長于野生型,這提示S1c33a1S113R雜合突變導致DRG軸突生長加快是神經(jīng)元的自主改變。最后,為了進一步明確BMP信號通路改變是S1c33a1wt/mut DRG軸突生長加速的重要因素,我們用Noggin做了拯救實驗。結果發(fā)現(xiàn),用Noggin處理能逆轉DRG外植體和DRG神經(jīng)元軸突生長加速的現(xiàn)象。以上結果說明,在體外水平,Slc33a1S113R雜合突變能通過改變BMP信號通路加快DRG神經(jīng)元軸突的生長,用Noggin處理能拯救S1c33a1wt/mut DRG軸突生長加速的表型。綜上所述,熨c33a1wt/mut小鼠出現(xiàn)HSP的相關表型,Slc33a1wt/mut小鼠可以作為研究HSP的疾病動物模型;S1c33a1S113R突變導致BMP信號通路增強與SPG42的發(fā)病相關;與野生型小鼠相比,Slc33a1wt/mut小鼠外周運動和感覺神經(jīng)損傷后再生能力和功能修復能力明顯增強,這與S1c33a1wt/mut小鼠神經(jīng)系統(tǒng)中BMP信號通路增強有關。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R741
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本文編號：1583167