本文選題：燒傷感染　切入點：鮑曼不動桿菌　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：感染是嚴(yán)重?zé)齻闹饕l(fā)癥,輕者可延誤創(chuàng)面愈合,重則可誘發(fā)膿毒癥,甚至多器官功能衰竭,是燒傷死亡的主要原因。嚴(yán)重?zé)齻颊哂捎隗w表生理防御屏障受損、全身免疫功能下降、壞死組織廣泛存在以及外界或自身菌群侵襲,其感染易感性大大增加。因此,燒傷感染的防治一直是燒傷救治領(lǐng)域的熱點和難點問題[1,2]。隨著抗生素在臨床上長期、廣泛和大量使用,細(xì)菌耐藥性的出現(xiàn)及日益嚴(yán)重化給臨床抗感染治療帶來了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)[3]。而燒傷病房中常見的細(xì)菌鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumannii)[3,4]、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)[5-8]、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[3,9-11]和克雷伯桿菌(Klebsiella pneumoniae)[10]等都是目前報道的耐藥率很高,耐藥現(xiàn)象非常普遍的幾大類細(xì)菌。由于傳統(tǒng)的抗生素的研發(fā)進(jìn)展非常緩慢,亟需其他的抗菌手段。在本次課題中,我們主要做了以下四個方面的研究:1)對自己醫(yī)院燒傷病房的鮑曼不動桿菌進(jìn)行了廣泛和全面的分子流行病學(xué)調(diào)查;2)分析噬菌體內(nèi)溶素PlyAB1在應(yīng)對泛耐藥鮑曼不動桿菌感染中的應(yīng)用;3)用細(xì)胞實驗和動物實驗初步分析了鮑曼不動桿菌噬菌體Abp1的安全性和有效性;4)分析CRISPR在抗感染領(lǐng)域的應(yīng)用。結(jié)果總結(jié)如下:1.對3年來的燒傷患者血液分離鮑曼不動桿菌分析,共收集到81株細(xì)菌。大多數(shù)菌株為多重耐藥菌株。除了多粘菌素B尚未發(fā)現(xiàn)有耐藥菌株外,米諾環(huán)素和頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉的耐藥率在30%和75%左右,剩下16種抗生素耐藥率高達(dá)90%以上。同時,這些細(xì)菌中耐藥基因檢出率高,檢測率較高的耐藥基因依次是OXA51、OXA23、AmpC、IS-Amp C、PER和SIM,其檢測率分別是96.3%,92.6%,86.4%,72.7%,72.7%和51.9%。81株血液分離菌被分到28個ST型別中,包含了10個已知的ST型別和18個新的ST型別。除了5個ST型(ST457,STn2,STn6,STn11和STn14)不屬于同一個克隆群,其余23個ST型的菌株(共76株)均屬于同一個克隆群,克隆復(fù)合體92。這也是目前世界上流行最多的鮑曼不動桿菌克隆復(fù)合體。2.進(jìn)一步對三年來分離的耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌進(jìn)行分析,共收集了248株細(xì)菌。主要分離部位依次是傷口表面(41%)、痰液(24%)、導(dǎo)管(15%)和血液(14%)四個部位,共占了全部樣本的94%。耐藥基因OXA23的檢出率呈現(xiàn)了上升趨勢,OXA23的檢出率從2012年的39%升高至2013年的77%。而且在不同的ST型別的細(xì)菌中,OXA23的攜帶率明顯不同,在ST95和ST191中,OXA23的檢出率僅為10%,但是在ST369中,90%(26/29)的菌株攜帶有OXA23基因。ST368始終是過去三年中的主導(dǎo)型別,但它所占的比例有所下降。同時ST型別組成也是每年都在發(fā)生變化,部分ST型別消失,部分新ST型別顯現(xiàn)出來。進(jìn)化分析提示這248株耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌大部分遺傳關(guān)系相近,這也提示我們控制醫(yī)院感染是鮑曼不動桿菌感染防治中的重要一步。3.經(jīng)過兩次去內(nèi)毒素純化后,噬菌體原液中內(nèi)毒素的含量降低了400多倍,從7.03*105 EU/ml降低到了1.70*103 EU/ml。使用Hela細(xì)胞和THP-1細(xì)胞研究了噬菌體對細(xì)胞的體外毒性作用,證實高達(dá)1010 PFU/ml的噬菌體作用過夜后未檢測到明顯的細(xì)胞毒性。細(xì)胞實驗表明,Hela細(xì)胞感染鮑曼不動桿菌2個小時后,給予MOI為100的噬菌體治療,可以達(dá)到拯救細(xì)胞被細(xì)菌感染而殺死的目的。最后,使用創(chuàng)面局部感染鮑曼不動桿菌和小鼠全身感染鮑曼不動桿菌模型,證實了噬菌體Abp1對于AB1引起的局部感染和全身感染都有很好的治療作用。4.基于前期的噬菌體基因組測序,尋找到了一個新的鮑曼不動桿菌噬菌體內(nèi)溶素,進(jìn)一步克隆表達(dá)和純化了該內(nèi)溶素PlyAB1。證實PlyAB1蛋白約21Kda左右,PlyAB1能迅速裂解鮑曼不動桿菌AB1,使得其OD600在30分鐘內(nèi)從1.0下降至0.2,活菌數(shù)量從1.4×107 CFU/ml降至4.1×106 CFU/ml。除了宿主菌AB1,還能裂解臨床分離的屬于不同型別的48株泛耐藥鮑曼不動桿菌。5.最后,使用CRISPR技術(shù),通過抑制細(xì)菌的prtR基因的表達(dá),控制細(xì)菌的數(shù)量。首先,我們成功將CRISPR-Cas9系統(tǒng)成功置入到銅綠假單胞菌中,進(jìn)而用攜帶CRISPR-Cas9系統(tǒng)的重組質(zhì)粒PHERDB20T-dCas9-prtR sgRNA證實它可以降低銅綠假單胞菌達(dá)103倍數(shù)量級。這些結(jié)果也證實了CRISPR技術(shù)在抗菌領(lǐng)域的應(yīng)用潛能。綜上所述,我們首先對病房中鮑曼不動桿菌進(jìn)行流行病學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)這些菌株耐藥率高,耐藥基因攜帶率也很高,而且大部分菌株屬于克隆復(fù)合體92。細(xì)胞實驗分析了噬菌體的安全性和有效性。并用動物創(chuàng)面感染實驗進(jìn)一步證實,噬菌體在全身及創(chuàng)面感染中的應(yīng)用。還發(fā)現(xiàn)了一個新的鮑曼不動桿菌噬菌體內(nèi)溶素,對臨床分離的泛耐藥鮑曼不動桿菌有較好的殺菌效果。最后我們嘗試使用CRISPR技術(shù)來控制細(xì)菌的感染,初步證實了其潛在的應(yīng)用價值。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R644

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本文編號：1582634