本文選題：多發(fā)性骨髓瘤　切入點：耐藥　出處：《浙江大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：研究背景:多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是一種單克隆漿細胞惡性增殖性疾病,臨床表現(xiàn)主要包括高鈣血癥、腎功能受損、貧血及溶骨性病變。目前MM發(fā)病率居血液系統(tǒng)惡性腫瘤第二位,僅次于淋巴瘤。MM的治療藥物主要包括傳統(tǒng)化療藥及新藥,隨著新藥(硼替佐米、雷那度胺等)及自體干細胞移植的應用,MM患者的生存已經(jīng)得到極大的改善和提升,但由于原發(fā)及繼發(fā)耐藥的發(fā)生,大部分MM患者最終進展復發(fā),使MM目前仍不可治愈。因此進一步探究MM的耐藥機制,尋找克服耐藥或增加藥物敏感性的方法,是臨床上迫切需要解決的問題。高遷移率族蛋白B1(high-mobility groupboxl,HMGB1)作為一種非組蛋白染色體結(jié)合蛋白,在DNA重組、修復及靶基因轉(zhuǎn)錄中起重要作用,同時HMGB1能夠被分泌或釋放至細胞外作為一種損傷相關模式分子(damage associated molecular patterns,DAMPs)與其受體結(jié)合參與炎癥、細胞分化、細胞遷移、血管生成及腫瘤轉(zhuǎn)移、耐藥等。研究發(fā)現(xiàn)HMGB1在多種腫瘤中過表達,參與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及耐藥,在血液系統(tǒng)惡性腫瘤如白血病、淋巴瘤中也發(fā)現(xiàn)有HMGB1的過表達,化療藥物促進白血病細胞釋放HMGB1,從而使其拮抗凋亡,同時HMGB1還能夠通過增加自噬誘導白血病細胞的耐藥。TLR4是HMGB1的重要受體之一,HMGB1能夠通過結(jié)合TLR4參與炎癥、血管生成、腫瘤生長及轉(zhuǎn)移等過程。我們前期研究發(fā)現(xiàn)TIR4的外源性配體脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)能夠通過與TLR4結(jié)合活化MM細胞內(nèi)NF-1κB和MAPK信號途徑,促進MM細胞增殖,同時能夠抑制化療藥物誘導的細胞凋亡。而在進一步研究中我們發(fā)現(xiàn)MM細胞能夠分泌TLR4的內(nèi)源性配體HMGB1。作為染色體結(jié)合蛋白及損傷相關模式分子,HMGB1是否介導MM耐藥的發(fā)生并不清楚,因此本研究擬在前期工作基礎上深入探索HMGB1在MM耐藥中的作用及機制。研究目的:1.明確原代MM細胞及MM細胞系中HMGB1的表達及分泌情況;2.構(gòu)建干擾HMGB1的慢病毒載體轉(zhuǎn)染MM細胞,明確內(nèi)源性HMGB1在MM生長及耐藥中的作用;3.分析化療藥物處理后MM細胞培養(yǎng)上清中HMGB1的變化,明確外源性HMGB1對MM細胞生長及耐藥的影響;4.體外及體內(nèi)實驗探索HMGB1介導MM耐藥的機制。研究方法:1.利用Western blot、qRT-PCR、免疫熒光技術(shù)及流式細胞分析術(shù)檢測MM患者原代標本及 MM 細胞株(MM.1S、RPMI8226、ARK、ARP-1、CAG、NCI-H929)中HMGB1及其受體的表達情況;ELISA方法檢測MM患者骨髓上清中HMGB1的分泌情況及化療藥物處理后細胞培養(yǎng)上清中HMGB1的變化;2.用外源性重組蛋白HMGB1(rhHMGB1)預處理MM細胞,利用MTT、CCK-8、流式細胞分析術(shù)檢測外源性HMGB1對MM細胞增殖及藥物誘導凋亡的影響;3.慢病毒載體構(gòu)建干擾HMGB1的MM細胞株(RPMI8226、CAG、MM.1S、ARK),利用CCK-8、流式細胞分析術(shù)、Western blot檢測內(nèi)源性HMGB1對MM細胞增殖及藥物誘導凋亡的影響;4.基因表達譜芯片篩選干擾HMGB1的MM細胞及其對照MM細胞中的差異基因,qRT-PCR及Western blot驗證芯片結(jié)果,并進一步探索相關信號通路的變化及其對MM細胞耐藥的影響;5.通過NOD/SCID小鼠皮下注射HMGB1干擾及對照組MM細胞(MM.1S-HMGB1 shRNA 及 MM.1S-control shRNA)構(gòu)建 MM 移植瘤小鼠模型,測量小鼠腫瘤體積同時免疫組織化學方法檢測腫瘤組織中相關蛋白的表達。研究結(jié)果:1.Western blot、qRT-PCR結(jié)果顯示HMGB1 在MM細胞株MM.1S、RPMI8226、ARK、ARP-1、CAG、NCI-H929及原代MM細胞(患者骨髓CD138+細胞)中均表達,qRT-PCR及流式細胞術(shù)結(jié)果顯示MM細胞株及原代MM細胞差異性表達HMGB1受體RAGE、TLR2、TLR4和TLR9,ELISA檢測結(jié)果顯示MM細胞株及MM患者骨髓上清中均存在HMGB1的分泌;免疫熒光結(jié)果顯示MM患者骨髓中CD138+漿細胞表達HMGB1;2.硼替佐米(bortezomib,Bor)及阿霉素(Adriamycin,ADM)能夠顯著抑制MM細胞的增殖同時伴隨MM細胞培養(yǎng)上清中HMGB 1釋放的增加;rhHMGB1預處理MM細胞后CCK8結(jié)果顯示rhHMGB 1對MM細胞的增殖無明顯影響;MTT及流式細胞術(shù)結(jié)果顯示rhHMGB1對Bor、ADM及地塞米松(Dexamethasone,Dex)誘導的MM細胞凋亡無明顯影響;3.CCK-8法檢測細胞增殖結(jié)果顯示干擾HMGB1后,MM細胞本身的增殖無顯著變化,而Dex抑制MM細胞增殖的能力增強(P0.05)。流式細胞術(shù)結(jié)果顯示干擾HMGB1對地Dex誘導的MM細胞周期阻滯無明顯影響。Annexin V-APC凋亡分析結(jié)果顯示干擾HMGB1后Dex、ADM及馬法蘭誘導的MM細胞凋亡顯著增加(P0.05)。Western blot結(jié)果顯示干擾HMGB1后地塞米松誘導的cPARP及c-Caspase3增加;4.基因表達譜芯片顯示干擾HMGB1后的RPMI8226及CAG中MM細胞生長、增殖及凋亡相關基因顯著變化,其中MM細胞促生長基因DEPTOR表達下降,抗凋亡基因Bcl-2、Bcl-xl表達下降,qRT-PCR(P0.05)及Western blot驗證了上述結(jié)果;5.Western blot進一步檢測相關信號通路發(fā)現(xiàn)干擾HMGB1后MM細胞內(nèi)mTOR通路活化增加、饑餓誘導的MM細胞自噬減少、Dex誘導的p38MAPK激活增加、NF-1κB通路受抑制;6.Western blot結(jié)果顯示干擾HMGB1后MM細胞本身及藥物誘導的MM細胞內(nèi)DNA損傷效應蛋白γH2A.X表達水平增加,7.體內(nèi)小鼠荷瘤結(jié)果顯示干擾HMGB1后抗凋亡蛋白Bcl-2、mTOR底物蛋白p4EBPl表達下降,pAkt(ser473)、γH2A.X表達增加,同時地塞米松用藥后c-caspase3、γH2A.X表達增加,HMGB1干擾組小鼠腫瘤負荷顯著低于對照組(P0.05)。結(jié)論:1.原代MM細胞及MM細胞株普遍表達HMGB1及其受體,同時能夠分泌HMGB1;2.化療藥物能夠促進MM細胞培養(yǎng)上清中HMGB1的釋放增加,但外源性rhHMGB1對MM細胞的增殖無影響,且不能保護MM細胞免受化療藥物誘導的凋亡;3.干擾HMGB1后MM細胞對化療藥物的敏感性顯著增加;4.內(nèi)源性HMGB1可能通過影響MM增殖凋亡相關基因的表達及相關信號通路的異常調(diào)控從而影響MM細胞對化療藥物的反應,參與MM耐藥;5.內(nèi)源性HMGB1可能通過調(diào)控MM細胞內(nèi)DNA損傷修復途徑參與MM細胞耐藥的發(fā)生。
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【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R733.3

【參考文獻】

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1 Zhe Liu;Yuanhong Xu;Jin Long;Kejian Guo;Chunlin Ge;Ruixia Du;;microRNA-218 suppresses the proliferation, invasion and promotes apoptosis of pancreatic cancer cells by targeting HMGB1[J];Chinese Journal of Cancer Research;2015年03期

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本文編號：1580054