本文選題：補(bǔ)腎活血化痰　切入點(diǎn)：Aβ毒性　出處：《湖北中醫(yī)藥大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:本論文從補(bǔ)腎活血化痰法的文獻(xiàn)探討出發(fā),梳理其基本概念和理論淵源,從而分析補(bǔ)腎活血化痰法對(duì)衰老及老年性癡呆的影響,同時(shí)整理并歸納分析了有關(guān)阿爾茲海默病(Alzheimer’s disease,簡(jiǎn)稱AD,老年癡呆癥的主要類型)病理過(guò)程中Aβ(amyloid-βpeptide)蛋白聚積毒性與氧化損傷之間關(guān)系的相關(guān)文獻(xiàn)。在此基礎(chǔ)上,從導(dǎo)師科研團(tuán)隊(duì)前期研究基礎(chǔ)出發(fā),以衰老和老年性癡呆為切入點(diǎn),選用補(bǔ)腎名方六味地黃丸作為補(bǔ)腎法代表方,通過(guò)與化痰法代表方二陳湯、活血法代表藥三七配伍進(jìn)行研究,分為六味地黃丸加三七(簡(jiǎn)稱補(bǔ)腎活血組)、六味地黃丸加二陳湯(簡(jiǎn)稱補(bǔ)腎化痰組)、六味地黃丸加二陳湯和三七(簡(jiǎn)稱補(bǔ)腎活血化痰組)等處理組,以秀麗線蟲(Caenorhabditis elegans)野生型(N2)和轉(zhuǎn)基因AD模型(CL4176)為研究對(duì)象,通過(guò)氧化水平調(diào)節(jié)、Aβ蛋白毒性緩解、衰老相關(guān)基因調(diào)控等方面的分析,闡釋補(bǔ)腎活血化痰法對(duì)防治癡呆和延緩衰老的作用機(jī)制,同時(shí)為抗AD藥物的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。方法:1.理論探討:整理補(bǔ)腎活血化痰治法對(duì)衰老和癡呆作用的文獻(xiàn),并探討現(xiàn)代研究補(bǔ)腎活血化痰藥的抗氧化作用與緩解Aβ蛋白毒性作用之間的關(guān)系,從而評(píng)價(jià)補(bǔ)腎活血化痰法對(duì)AD和衰老的作用,并初步判斷其作用機(jī)制。2.實(shí)驗(yàn)研究:分別選用N2(野生型)和CL4176(轉(zhuǎn)基因AD模型)秀麗線蟲為動(dòng)物模型進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究。其中,CL4176秀麗線蟲因其肌肉細(xì)胞中Aβ的表達(dá)在表型上出現(xiàn)抽搐癥狀,同時(shí)具有AD相關(guān)癥狀和病理變化。本論文首先進(jìn)行了癱瘓緩解實(shí)驗(yàn),以此篩選具有緩解Aβ毒性作用的活性藥物組及藥物有效濃度。同時(shí),通過(guò)百草枯氧化脅迫實(shí)驗(yàn),篩選出具有抗氧化作用的藥物組及有效濃度。然后通過(guò)比較分析藥物抗氧化作用與緩解Aβ毒性之間的關(guān)系,確定具有抗氧化且能緩解Aβ毒性的活性藥物組及其有效濃度。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步開(kāi)展了以下系列實(shí)驗(yàn):壽命、熱應(yīng)激、繁殖能力、運(yùn)動(dòng)能力等衰老相關(guān)實(shí)驗(yàn),以分析活性藥物對(duì)衰老的影響;活性氧(ROS)水平、SOD和CAT等抗氧化酶活性以及丙二醛(MDA)含量測(cè)定,以探討活性藥物對(duì)氧化應(yīng)激的影響;通過(guò)熒光定量PCR對(duì)氧化應(yīng)激相關(guān)基因skn-1/Nrf2以及熱休克蛋白家族基因hsp16.2和hsp60等進(jìn)行分析,以探討藥物防治AD及延緩衰老的作用機(jī)制;采用硫磺素T(Th T)染色法進(jìn)行Aβ蛋白體外聚集實(shí)驗(yàn),以檢測(cè)藥物對(duì)Aβ蛋白聚集的作用。通過(guò)以上實(shí)驗(yàn),探討補(bǔ)腎活血化痰法對(duì)于AD作用機(jī)制及其與壽命影響之間的可能關(guān)系。結(jié)果:1.對(duì)秀麗線蟲體內(nèi)Aβ毒性作用的影響:藥物對(duì)秀麗線蟲癱瘓緩解程度可以反映藥物對(duì)秀麗線蟲Aβ毒性的作用。通過(guò)誘導(dǎo)癱瘓后對(duì)秀麗線蟲進(jìn)行計(jì)數(shù)和分析,發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎組、補(bǔ)腎活血組、補(bǔ)腎化痰組和補(bǔ)腎活血化痰組均具有緩解Aβ蛋白毒性的作用,其中補(bǔ)腎組、補(bǔ)腎活血組和補(bǔ)腎化痰組有效作用的最佳濃度均為50 mg/ml,補(bǔ)腎活血化痰組有效作用的最佳濃度為100 mg/ml。通過(guò)進(jìn)一步對(duì)四種治法緩解Aβ毒性的效果進(jìn)行比較分析,發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎活血組緩解效果最明顯,其余依次為補(bǔ)腎活血化痰組、補(bǔ)腎化痰組和補(bǔ)腎組。因本實(shí)驗(yàn)在固體培養(yǎng)基上開(kāi)展,因此所獲得的最佳藥物濃度為后續(xù)固體培養(yǎng)法的實(shí)驗(yàn)濃度。2.對(duì)秀麗線蟲抗氧化能力的影響:抗氧化相關(guān)實(shí)驗(yàn)包括百草枯氧化脅迫實(shí)驗(yàn)、體內(nèi)ROS水平、SOD和CAT活性以及MDA含量等的檢測(cè)。通過(guò)百草枯氧化脅迫造模,觀察抗氧化損傷后秀麗線蟲存活時(shí)間來(lái)反映藥物的抗氧化能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與空白組比較,藥物組均能明顯提高秀麗線蟲在百草枯脅迫下的存活能力,補(bǔ)腎組最佳有效濃度為40mg/ml,補(bǔ)腎活血組為60mg/ml,補(bǔ)腎化痰組為0-100h內(nèi)最佳濃度為40mg/ml,100h以后為60mg/ml,補(bǔ)腎活血化痰組為60mg/ml,將篩選濃度后的各組方最佳濃度再次進(jìn)行氧化脅迫實(shí)驗(yàn),得到結(jié)果顯示,在0-120h內(nèi),以補(bǔ)腎活血化痰組效果最佳,120h以后補(bǔ)腎活血組效果最佳,其次為補(bǔ)腎化痰組和補(bǔ)腎組,此實(shí)驗(yàn)以液體培養(yǎng)進(jìn)行,因此所確定的有效濃度為液體培養(yǎng)法濃度。通過(guò)ROS水平檢測(cè),發(fā)現(xiàn)各組藥物均可顯著降低秀麗線蟲體內(nèi)的ROS水平,其中補(bǔ)腎活血組ROS水平最低,其次為補(bǔ)腎活血化痰組、補(bǔ)腎化痰組,補(bǔ)腎組效果較其他藥物組ROS水平低,因此,藥物抗氧化作用效果由大到小依次為補(bǔ)腎活血組、補(bǔ)腎活血化痰組、補(bǔ)腎化痰組和補(bǔ)腎組;相比于空白對(duì)照組,補(bǔ)腎組及其他藥物組均能顯著增強(qiáng)氧化脅迫造模后秀麗線蟲體內(nèi)SOD活力,其中以補(bǔ)腎活血組SOD活力最為明顯(p0.01),其次為補(bǔ)腎活血化痰組(p0.05)、補(bǔ)腎化痰組(p0.05)、補(bǔ)腎組(p0.05)。CAT活力最強(qiáng)為補(bǔ)腎活血化痰組(p0.05),其次為補(bǔ)腎活血組(p0.05)、補(bǔ)腎化痰組(p0.05)、補(bǔ)腎組(p0.05)。對(duì)比空白組,補(bǔ)腎活血化痰組能顯著降低氧化脅迫下秀麗線蟲體內(nèi)的MDA含量(p0.01),其次為補(bǔ)腎化痰組(p0.05)、補(bǔ)腎活血組(p0.05)。補(bǔ)腎組結(jié)果顯示MDA含量無(wú)明顯降低。補(bǔ)腎活血化痰法可通過(guò)抗氧化損傷,緩解Aβ毒性,保護(hù)神經(jīng)元,體現(xiàn)了補(bǔ)腎活血化痰法在對(duì)抗秀麗線蟲Aβ毒性作用過(guò)程中發(fā)揮了主要作用。3.對(duì)秀麗線蟲壽命的影響:壽命相關(guān)實(shí)驗(yàn)包括固體壽命實(shí)驗(yàn)、熱應(yīng)激實(shí)驗(yàn)、繁殖力實(shí)驗(yàn)、運(yùn)動(dòng)能力實(shí)驗(yàn)等。壽命實(shí)驗(yàn)中藥物為癱瘓緩解實(shí)驗(yàn)所篩選出的最佳濃度,補(bǔ)腎組、補(bǔ)腎化痰組和補(bǔ)腎活血組濃度取50mg/ml,補(bǔ)腎活血化痰組濃度取100mg/ml,壽命實(shí)驗(yàn)結(jié)果,與空白組壽命周期比較,各藥物組均能顯著延長(zhǎng)秀麗線蟲的平均壽命,其空白組平均壽命為18.975±0.175天,補(bǔ)腎組平均壽命為21.842±0.190天(p0.05),補(bǔ)腎活血組平均壽命為22.943±0.194天(p0.05),補(bǔ)腎活血化痰組平均壽命為25.651±0.106天(p0.001),結(jié)果均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。四種治法延緩衰老的效果進(jìn)行綜合比較,補(bǔ)腎活血化痰組抗衰效果最佳,其次為補(bǔ)腎活血組,其次補(bǔ)腎化痰組,最后為補(bǔ)腎組;熱應(yīng)激實(shí)驗(yàn)結(jié)果,與空白組比較,各藥物組均可延長(zhǎng)秀麗線蟲熱應(yīng)激時(shí)平均存活時(shí)間,其中補(bǔ)腎化痰組抗熱應(yīng)激效果最佳,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001),熱應(yīng)激效果其他藥物組依次為補(bǔ)腎活血組、補(bǔ)腎組、補(bǔ)腎化痰組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);繁殖力實(shí)驗(yàn)結(jié)果,生殖高峰期子代數(shù)目,空白組為168.7±25.2條,補(bǔ)腎組(50mg/ml)為244.7±22.8條(p0.001),補(bǔ)腎活血組為280.6±20.7條(p0.001),補(bǔ)腎化痰組235.7±19.1條(p0.001),補(bǔ)腎活血化痰組為274.7±20.5條(p0.001),對(duì)比于空白組,各藥物組均明顯提高秀麗線蟲生殖能力(P0.01),其中補(bǔ)腎活血組作用更為顯著,其他藥物效果依次為補(bǔ)腎活血化痰組、補(bǔ)腎組、補(bǔ)腎化痰組,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;運(yùn)動(dòng)能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果,身體彎曲次數(shù)最多為補(bǔ)腎活血組,表明補(bǔ)腎活血法對(duì)運(yùn)動(dòng)能力的影響明顯優(yōu)于其他組,其次為補(bǔ)腎活血化痰組、補(bǔ)腎組,和補(bǔ)腎化痰組。4.補(bǔ)腎活血化痰法對(duì)抗氧化基因、主要熱休克蛋白家族基因的影響以Real-Time PCR的2-△△CT值表示相關(guān)基因在秀麗線蟲體內(nèi)的m RNA的相對(duì)表達(dá)水平。各藥物組結(jié)果,與act-1 m RNA相比,skn-1 m RNA水平明顯上調(diào),表明補(bǔ)腎活血化痰法緩解秀麗線蟲Aβ毒性作用機(jī)制可能與skn-1/Nrf2抗氧化作用途徑有關(guān)。使用RT-PCR的方法進(jìn)一步探究了藥物對(duì)于主要熱休克蛋白家族基因表達(dá)情況的影響,主要研究了熱休克蛋白家族代表如hsp-16.2、hsp-60基因的表達(dá)情況,結(jié)果顯示AD模型線蟲體內(nèi),補(bǔ)腎活血化痰法對(duì)熱休克蛋白基因hsp-16.2 m RNA、hsp-60 m RNA表達(dá)未見(jiàn)明顯上調(diào)或下調(diào)。5.補(bǔ)腎活血化痰法對(duì)Aβ蛋白體外聚集的影響結(jié)果顯示,藥物與Aβ一起孵育,但并不影響Aβ蛋白體外聚集過(guò)程,因此結(jié)果表明,補(bǔ)腎活血化痰法對(duì)線蟲體內(nèi)Aβ的清除作用不是通過(guò)直接競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合Aβ蛋白單體實(shí)現(xiàn)的,而很可能是通過(guò)與體內(nèi)某些應(yīng)激壓力作用有關(guān)。結(jié)論:1.補(bǔ)腎活血化痰法對(duì)于延緩Aβ毒性及延緩壽命均具有顯著作用,其治療作用明顯優(yōu)于補(bǔ)腎法、補(bǔ)腎活血及補(bǔ)腎化痰法,抗氧化作用則以補(bǔ)腎活血法最為顯著。2.對(duì)緩解Aβ毒性作用有效的藥物多具有抗氧化活性,且對(duì)于壽命均有一定程度的延長(zhǎng)作用,說(shuō)明抗AD作用的藥物對(duì)健康壽命具有積極促進(jìn)作用。3.補(bǔ)腎活血化痰法作用于AD秀麗線蟲主要是通過(guò)體內(nèi)抗氧化應(yīng)激作用,且此作用具有延緩衰老、提高抗氧化酶活性等作用。4.補(bǔ)腎活血化痰法緩解Aβ蛋白毒性作用機(jī)制,不是通過(guò)調(diào)控?zé)嵝菘说鞍准易寤蚧蚋?jìng)爭(zhēng)性結(jié)合而改變Aβ蛋白空間構(gòu)象來(lái)發(fā)揮作用,很可能與skn-1/Nrf2介導(dǎo)的抗氧化作用機(jī)制相關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：湖北中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R285.5

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