本文關(guān)鍵詞： 尼古丁 雙酚A 心肌特異性轉(zhuǎn)錄因子 microRNA　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：先天性心臟病(先心病)是目前最常見的一種出生缺陷,并發(fā)癥較多,嚴(yán)重威脅患兒的生命,對社會和家庭造成了極大的影響。已有研究表明,遺傳因素和環(huán)境因素是導(dǎo)致先心病的兩大主要致病因素。這兩種因素單獨(dú)作用或者相互作用均可使胚胎心臟發(fā)育異常。因此,深入研究先心病的發(fā)病機(jī)制以控制其發(fā)病率顯得極其重要。大量的研究發(fā)現(xiàn),香煙中的尼古丁和環(huán)境中無處不在的雙酚A均可對心血管疾病以及胚胎發(fā)育產(chǎn)生影響。本課題組前期的研究表明,孕期大鼠給予高劑量的尼古丁能夠?qū)е伦哟笫笮呐K間隔缺損,可能與心臟特性轉(zhuǎn)錄因子GATA4、TBX5啟動子區(qū)域DNA的甲基化升高有關(guān),為了進(jìn)一步探索尼古丁和雙酚A可能引起先心病的分子機(jī)制,我們開展了以下研究。研究方法:1、通過單層分化的方法,誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞hESC-H9定向分化為心肌細(xì)胞,并將其作為體外胚胎心臟發(fā)育的模型。通過探索最佳的分化條件,使胚胎干細(xì)胞能高效而穩(wěn)定地分化為成熟的、有自動節(jié)律的心肌細(xì)胞。2、通過CCK-8實(shí)驗(yàn)確定尼古丁干預(yù)分化過程的最適濃度,觀察不同濃度的尼古丁對干細(xì)胞心肌分化的影響,采用熒光定量PCR(RT-qPCR)、蛋白質(zhì)印記(Westernblot)、免疫熒光等方法檢測分化過程中心臟特異性轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量的改變。3、通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變和CCK-8實(shí)驗(yàn),確定尼古丁和雙酚A混合物干預(yù)干細(xì)胞心肌分化的最適濃度。采用Western blot檢測分化不同時間點(diǎn)心肌細(xì)胞標(biāo)志物的蛋白表達(dá),并用RT-qPCR檢測分化第3天、第7天和第14天不同濃度混合物對胚胎干細(xì)胞干性指標(biāo)Nanog、Sox2、Oct4的影響,并篩選出變化明顯的miR-125b作為后續(xù)分子機(jī)制的研究對象。4、通過給予miR-125b-mimic和miR-125b-inhibitor來進(jìn)行過表達(dá)和抑制功能實(shí)驗(yàn),進(jìn)一步證實(shí)在分化過程中miR-125b和Lin28的靶向關(guān)系,以及對分化的影響。研究結(jié)果:1、hESC-H9能高效并穩(wěn)定地分化為有自動節(jié)律跳動的心肌細(xì)胞的首要條件是在干細(xì)胞的匯合度達(dá)到85%左右時進(jìn)行分化實(shí)驗(yàn),干細(xì)胞匯合度過低或者過高都會極大影響分化結(jié)果。此方法可以使無飼養(yǎng)層的hESC-H9不經(jīng)過擬胚體階段直接分化形成成熟的心肌細(xì)胞。這些心肌細(xì)胞有明顯的自動節(jié)律性,并能高表達(dá)成熟心肌細(xì)胞的分子標(biāo)志物c-TnT、c-TnI、MHC等。2、尼古丁能延長hESC-H9定向心肌分化過程的時間,減少自發(fā)跳動的心肌細(xì)胞的數(shù)量、范圍和頻率,以高濃度組(100 μM)的尼古丁干預(yù)組現(xiàn)象更顯著。不同濃度的尼古丁干預(yù)分化過程時,100 μM濃度的尼古丁能顯著減低分化第3天中胚層特異性標(biāo)志物Mesp1和Brachyury的蛋白表達(dá)水平。我們初步推測尼古丁延長hESC-H9定向心肌分化時間是通過抑制分化過程中中胚層的形成來實(shí)現(xiàn)的。在分化第14天時,我們發(fā)現(xiàn)尼古丁能劑量依賴性的降低心肌特異性轉(zhuǎn)錄因子GATA4和Tbx5的mRNA表達(dá)水平,因此我們進(jìn)一步推測尼古丁抑制定向心肌分化是通過抑制GATA4和Tbx5來實(shí)現(xiàn)的。3、尼古丁和雙酚A(N+B)混合物能抑制hESC-H9定向心肌分化,以高濃度組(10μM)抑制作用最明顯。首先通過RT-qPCR篩選出hESC-H9定向心肌分化過程中變化最為顯著的三種miRNA(miRNA-1、miRNA-134和miR-125b),其次發(fā)現(xiàn)不同濃度N+B混合物(0.1μM、1μM、10μM)處理分化過程后,與對照組相比,在分化的不同時間段能上調(diào)干性標(biāo)志物Nanog、Oct4、Sox2的mRNA的表達(dá)量,而miRNA-134的表達(dá)水平卻明顯下降;通過過表miR-125b功能實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),與對照組相比,N+B高濃度組(10μM)在分化的第7天和第14天均能顯著抑制其靶基因Lin28的mRNA表達(dá)水平。通過miR-125b缺失功能實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),與未轉(zhuǎn)染組(0D-CT)相比較,未分化的hESC-H9轉(zhuǎn)染組(0D-inhibitor)中Lin28的mRNA表達(dá)水平顯著增加。從分化開始到分化的第7天,Lin28的mRNA表達(dá)量隨時間不斷增加,但相對于未給藥的轉(zhuǎn)染組(CT-inhibitor),高濃度轉(zhuǎn)染組(10μM-inhibitor)能降低Lin28的mRNA表達(dá)量,并有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。4、研究結(jié)論:本研究首先探索了直接、穩(wěn)定和高效的單層定向心肌分化方法,使人胚胎干細(xì)胞最終形成自發(fā)性跳動地成熟心肌細(xì)胞。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們推測尼古丁可能通過延緩中胚層的形成以及降低心肌特異性轉(zhuǎn)錄因子GATA4和Tbx5的水平來達(dá)到抑制心肌分化的作用。高濃度的N+B混合物(10 μM)抑制心肌分化的機(jī)制可能有以下兩個方面,一是通過抑制miRNA134的表達(dá),上調(diào)分化過程中細(xì)胞干性標(biāo)志物的表達(dá),導(dǎo)致細(xì)胞牽制在干性狀態(tài),進(jìn)而抑制了心肌分化;二是通過miR-125b/Lin28的途徑來抑制心肌分化。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R725.4

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 ;美科學(xué)家用人體胚胎干細(xì)胞培育出血管[J];世界科技研究與發(fā)展;2002年03期

2 ;法科學(xué)家首次用胚胎干細(xì)胞培育出生殖細(xì)胞[J];世界科技研究與發(fā)展;2003年03期

3 ;日本首次培育出人體胚胎干細(xì)胞[J];世界科技研究與發(fā)展;2003年04期

4 朱燕;淺談胚胎干細(xì)胞[J];衛(wèi)生職業(yè)教育;2004年22期

5 ;韓科學(xué)家為病人定制出胚胎干細(xì)胞[J];河南醫(yī)學(xué)研究;2005年02期

6 王正朝;許衛(wèi)華;龐訓(xùn)勝;石放雄;王鋒;;胚胎干細(xì)胞的鑒定方法(英文)[J];中國臨床康復(fù);2006年05期

7 李瀟;;創(chuàng)建干細(xì)胞而不損傷正常胚胎[J];中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報;2006年07期

8 華進(jìn)聯(lián);楊煒峰;竇忠英;;胚胎干細(xì)胞與生殖細(xì)胞[J];中國臨床康復(fù);2006年33期

9 王靜舒;;胚胎干細(xì)胞[J];日本醫(yī)學(xué)介紹;2006年10期

10 ;日本發(fā)明大量培養(yǎng)人體胚胎干細(xì)胞新方法[J];中國科技產(chǎn)業(yè);2007年06期

相關(guān)會議論文 前10條

1 付強(qiáng);王珂;王常勇;;心肌方向分化和富集對胚胎干細(xì)胞在心肌缺血部位移植后致腫瘤能力的影響[A];中華醫(yī)學(xué)會第11次心血管病學(xué)術(shù)會議論文摘要集[C];2009年

2 趙惠萍;王綺如;;骨髓內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)液促進(jìn)胚胎干細(xì)胞的造血分化[A];湖南省生理科學(xué)會新世紀(jì)學(xué)術(shù)年會論文摘要匯編[C];2002年

3 姚玲玲;朱依純;;胚胎干細(xì)胞分化潛能研究進(jìn)展[A];中國生理學(xué)會論文匯編2004年第二期[C];2004年

4 黃華容;徐超;趙小立;陳良標(biāo);張銘;;誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞定向分化成平滑肌的研究[A];華東六省一市生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)會2006年學(xué)術(shù)交流會論文集[C];2006年

5 王樹玉;張軍;任國慶;;胚胎干細(xì)胞的研究進(jìn)展[A];第五屆全國優(yōu)生科學(xué)大會論文匯編[C];2000年

6 印惠s，

本文編號：1555506