本文關(guān)鍵詞： 尼古丁 雙酚A 心肌特異性轉(zhuǎn)錄因子 microRNA　出處：《南方醫(yī)科大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：先天性心臟病(先心病)是目前最常見的一種出生缺陷,并發(fā)癥較多,嚴重威脅患兒的生命,對社會和家庭造成了極大的影響。已有研究表明,遺傳因素和環(huán)境因素是導致先心病的兩大主要致病因素。這兩種因素單獨作用或者相互作用均可使胚胎心臟發(fā)育異常。因此,深入研究先心病的發(fā)病機制以控制其發(fā)病率顯得極其重要。大量的研究發(fā)現(xiàn),香煙中的尼古丁和環(huán)境中無處不在的雙酚A均可對心血管疾病以及胚胎發(fā)育產(chǎn)生影響。本課題組前期的研究表明,孕期大鼠給予高劑量的尼古丁能夠?qū)е伦哟笫笮呐K間隔缺損,可能與心臟特性轉(zhuǎn)錄因子GATA4、TBX5啟動子區(qū)域DNA的甲基化升高有關(guān),為了進一步探索尼古丁和雙酚A可能引起先心病的分子機制,我們開展了以下研究。研究方法:1、通過單層分化的方法,誘導人胚胎干細胞hESC-H9定向分化為心肌細胞,并將其作為體外胚胎心臟發(fā)育的模型。通過探索最佳的分化條件,使胚胎干細胞能高效而穩(wěn)定地分化為成熟的、有自動節(jié)律的心肌細胞。2、通過CCK-8實驗確定尼古丁干預分化過程的最適濃度,觀察不同濃度的尼古丁對干細胞心肌分化的影響,采用熒光定量PCR(RT-qPCR)、蛋白質(zhì)印記(Westernblot)、免疫熒光等方法檢測分化過程中心臟特異性轉(zhuǎn)錄因子表達量的改變。3、通過細胞形態(tài)學的改變和CCK-8實驗,確定尼古丁和雙酚A混合物干預干細胞心肌分化的最適濃度。采用Western blot檢測分化不同時間點心肌細胞標志物的蛋白表達,并用RT-qPCR檢測分化第3天、第7天和第14天不同濃度混合物對胚胎干細胞干性指標Nanog、Sox2、Oct4的影響,并篩選出變化明顯的miR-125b作為后續(xù)分子機制的研究對象。4、通過給予miR-125b-mimic和miR-125b-inhibitor來進行過表達和抑制功能實驗,進一步證實在分化過程中miR-125b和Lin28的靶向關(guān)系,以及對分化的影響。研究結(jié)果:1、hESC-H9能高效并穩(wěn)定地分化為有自動節(jié)律跳動的心肌細胞的首要條件是在干細胞的匯合度達到85%左右時進行分化實驗,干細胞匯合度過低或者過高都會極大影響分化結(jié)果。此方法可以使無飼養(yǎng)層的hESC-H9不經(jīng)過擬胚體階段直接分化形成成熟的心肌細胞。這些心肌細胞有明顯的自動節(jié)律性,并能高表達成熟心肌細胞的分子標志物c-TnT、c-TnI、MHC等。2、尼古丁能延長hESC-H9定向心肌分化過程的時間,減少自發(fā)跳動的心肌細胞的數(shù)量、范圍和頻率,以高濃度組(100 μM)的尼古丁干預組現(xiàn)象更顯著。不同濃度的尼古丁干預分化過程時,100 μM濃度的尼古丁能顯著減低分化第3天中胚層特異性標志物Mesp1和Brachyury的蛋白表達水平。我們初步推測尼古丁延長hESC-H9定向心肌分化時間是通過抑制分化過程中中胚層的形成來實現(xiàn)的。在分化第14天時,我們發(fā)現(xiàn)尼古丁能劑量依賴性的降低心肌特異性轉(zhuǎn)錄因子GATA4和Tbx5的mRNA表達水平,因此我們進一步推測尼古丁抑制定向心肌分化是通過抑制GATA4和Tbx5來實現(xiàn)的。3、尼古丁和雙酚A(N+B)混合物能抑制hESC-H9定向心肌分化,以高濃度組(10μM)抑制作用最明顯。首先通過RT-qPCR篩選出hESC-H9定向心肌分化過程中變化最為顯著的三種miRNA(miRNA-1、miRNA-134和miR-125b),其次發(fā)現(xiàn)不同濃度N+B混合物(0.1μM、1μM、10μM)處理分化過程后,與對照組相比,在分化的不同時間段能上調(diào)干性標志物Nanog、Oct4、Sox2的mRNA的表達量,而miRNA-134的表達水平卻明顯下降;通過過表miR-125b功能實驗發(fā)現(xiàn),與對照組相比,N+B高濃度組(10μM)在分化的第7天和第14天均能顯著抑制其靶基因Lin28的mRNA表達水平。通過miR-125b缺失功能實驗發(fā)現(xiàn),與未轉(zhuǎn)染組(0D-CT)相比較,未分化的hESC-H9轉(zhuǎn)染組(0D-inhibitor)中Lin28的mRNA表達水平顯著增加。從分化開始到分化的第7天,Lin28的mRNA表達量隨時間不斷增加,但相對于未給藥的轉(zhuǎn)染組(CT-inhibitor),高濃度轉(zhuǎn)染組(10μM-inhibitor)能降低Lin28的mRNA表達量,并有統(tǒng)計學差異。4、研究結(jié)論:本研究首先探索了直接、穩(wěn)定和高效的單層定向心肌分化方法,使人胚胎干細胞最終形成自發(fā)性跳動地成熟心肌細胞。根據(jù)實驗結(jié)果,我們推測尼古丁可能通過延緩中胚層的形成以及降低心肌特異性轉(zhuǎn)錄因子GATA4和Tbx5的水平來達到抑制心肌分化的作用。高濃度的N+B混合物(10 μM)抑制心肌分化的機制可能有以下兩個方面,一是通過抑制miRNA134的表達,上調(diào)分化過程中細胞干性標志物的表達,導致細胞牽制在干性狀態(tài),進而抑制了心肌分化;二是通過miR-125b/Lin28的途徑來抑制心肌分化。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R725.4

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6 印惠s，

本文編號：1555506