發(fā)布時間：2018-03-02 03:08

  本文關(guān)鍵詞： DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶1 葉酸 甲基硝基亞硝基胍 表觀遺傳學(xué) 哈薩克族 信號通路　出處：《新疆醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:1)構(gòu)建哈族食管上皮DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1)高表達(dá)細(xì)胞株模型,為今后食管癌發(fā)生機(jī)制研究提供重要的研究工具;2)探討DNMT1高表達(dá)在N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)致哈族食管上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中的作用,并構(gòu)建哈族食管上皮DNMT1高表達(dá)細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞模型,為今后深入探討食管癌發(fā)生機(jī)制提供穩(wěn)定的、簡單易行的實驗操作方法和研究工具;3)探討葉酸在M N N G致哈族食管上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中的干預(yù)作用和表觀遺傳學(xué)機(jī)制以及Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控機(jī)制中的作用,為哈族食管癌的防治提供理論依據(jù)。方法:1)采用TALE技術(shù)將構(gòu)建的p XanthoT M V.b a s i c.p u r o-W V 0 1 3 3、p XanthoTMV.basic.puro-WV0132和p XanthoTMV.basic.puro-WV072質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至哈族食管上皮細(xì)胞,并利用嘌呤霉素對DNMT1高表達(dá)細(xì)胞進(jìn)行篩選,通過熒光顯微鏡、RT-PCR和Western blot法檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況和目的基因DNMT1的表達(dá)情況;2)采用MTT法和克隆形成實驗確定MNNG的惡性轉(zhuǎn)化劑量;采用隔代染毒,每次染毒1小時的方法對細(xì)胞進(jìn)行染毒,之后取不同代次細(xì)胞行軟瓊脂集落形成實驗,觀察不同染毒次數(shù)和傳代次數(shù)的細(xì)胞集落形成情況,并克隆擴(kuò)大培養(yǎng)哈族食管上皮細(xì)胞-zhz(惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞);裸鼠成瘤實驗選用SPF級BALB/c-nu裸鼠24只,按照隨機(jī)化原則分為3組,即對照組(生理鹽水組),哈族食管上皮DNMT1高表達(dá)細(xì)胞組和哈族食管上皮DNMT1高表達(dá)細(xì)胞轉(zhuǎn)化細(xì)胞組(哈族食管上皮細(xì)胞-zhz),每組8只,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個/m L,按0.2m L/只的劑量接種于裸鼠靠近右側(cè)背部皮下,4周后觀察哈族食管上皮DNMT1高表達(dá)細(xì)胞及其轉(zhuǎn)化細(xì)胞(哈族食管上皮細(xì)胞-zhz)惡變程度,并進(jìn)行組織病理學(xué)檢測;3)采用高效液相色譜法(HPLC)測定基因組DNA整體甲基化水平改變;采用甲基化特異性PCR(MSP)法、RT-PCR和Western Blot法檢測葉酸代謝相關(guān)基因(MTHFR和CBS)、DNA修復(fù)基因(MGMT)和腫瘤相關(guān)基因(P16、RASSF1A和FHIT)等6個基因甲基化狀態(tài)、m RNA和蛋白表達(dá)水平改變;4)采用RT-PCR及Western Blot法檢測Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中關(guān)鍵因子(β-catenin、APC和TCF)mRNA及蛋白表達(dá)水平改變。結(jié)果:1)pXanthoTMV.basic.puro-WV0133和pXanthoTMV.basic.puro-WV0132質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞DNMT1 mRNA表達(dá)水平是正常細(xì)胞組的1.786倍和2.721倍,dnmt1蛋白表達(dá)水平是正常細(xì)胞組的2.734倍和3.100倍;其中,pxanthotmv.basic.puro-wv0132質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞dnmt1mrna和蛋白表達(dá)水平較高;2)隨著mnng染毒次數(shù)和細(xì)胞傳代次數(shù)的增加,細(xì)胞形態(tài)趨向不規(guī)則形,接觸抑制逐漸消失,耐受性逐漸增強(qiáng),生長速度逐漸增加。染毒14次第27代的哈族食管上皮dnmt1高表達(dá)細(xì)胞在軟瓊脂上出現(xiàn)細(xì)胞集落,中央凸起,由多層細(xì)胞組成,而哈族食管上皮細(xì)胞未出現(xiàn)陽性結(jié)果,細(xì)胞固縮死亡。接種哈族食管上皮轉(zhuǎn)化細(xì)胞-zhz的裸鼠出現(xiàn)腫瘤包塊,經(jīng)組織病理學(xué)鑒定為鱗癌;3)在終濃度為1.500×10-5mol/lmnng致癌物的長期暴露之下,(1)隨著葉酸濃度的增加,哈族食管上皮細(xì)胞和dnmt1高表達(dá)細(xì)胞dna整體甲基化水平逐漸升高(p0.01)和dnmt1酶活性逐漸降低(p0.01);隨著作用時間的延長,哈族食管上皮細(xì)胞和dnmt1高表達(dá)細(xì)胞dna整體甲基化水平逐漸降低(p0.01),dnmt1酶活性逐漸升高(p0.01);在相同條件下,晚期階段的哈族食管上皮細(xì)胞dna整體甲基化水平高于哈族食管上皮dnmt1高表達(dá)細(xì)胞組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t早=0.696,p=0.494;t中=0.605,p=0.551;t晚=2.746,p=0.012);(2)葉酸濃度的增加對哈族食管上皮細(xì)胞和dnmt1高表達(dá)細(xì)胞mthfr、rassf1a和fhit(除哈族食管上皮細(xì)胞外)基因甲基化狀態(tài)有影響,表現(xiàn)為在葉酸高濃度劑量時,mthfr、rassf1a和fhit甲基化出現(xiàn)逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象,而對cbs、mgmt和p16基因甲基化狀態(tài)無影響;(3)隨著葉酸濃度的增加,哈族食管上皮細(xì)胞和dnmt1高表達(dá)細(xì)胞mthfr、cbs、mgmt、p16、rassf1a和fhit基因mrna和蛋白表達(dá)水平逐漸增加(p0.01);隨著作用時間的延長,細(xì)胞mthfr、cbs、mgmt、p16、rassf1a和fhit基因mrna和蛋白表達(dá)水平逐漸降低(p0.01);在相同條件下,哈族食管上皮細(xì)胞mthfr、cbs、mgmt、p16、rassf1a和fhit基因mrna和蛋白表達(dá)整體上高于哈族食管上皮dnmt1高表達(dá)細(xì)胞(p0.01);4)隨著葉酸濃度的增加,哈族食管上皮細(xì)胞和dnmt1高表達(dá)細(xì)胞wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中關(guān)鍵因子β-catenin和tcf基因mrna和蛋白表達(dá)水平逐漸降低,apc基因逐漸增加,呈現(xiàn)出濃度依賴關(guān)系;隨著干預(yù)時間的延長,各葉酸濃度組細(xì)胞β-catenin和tcf基因mrna和蛋白表達(dá)水平均逐漸增加趨勢,apc基因逐漸降低,呈現(xiàn)出時間依賴關(guān)系;在相同條件下,哈族食管上皮細(xì)胞β-catenin和tcfmrna和蛋白表達(dá)水平低于哈族食管上皮dnmt1高表達(dá)細(xì)胞,apc基因mrna和蛋白表達(dá)水平高于哈族食管上皮dnmt1高表達(dá)細(xì)胞。結(jié)論:1)采用tale技術(shù)成功構(gòu)建了哈族食管dnmt1高表達(dá)細(xì)胞株模型,為今后致癌機(jī)制研究提供了重要的研究工具;2)成功構(gòu)建了哈族食管上皮dnmt1高表達(dá)細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞模型,dnmt1高表達(dá)對細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化起到促進(jìn)作用,可使細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的時間縮短;3)與哈族食管上皮細(xì)胞相比,哈族食管上皮dnmt1高表達(dá)細(xì)胞更易受到mnng和低劑量葉酸的損害作用影響,提示高濃度葉酸可降低MNNG對細(xì)胞的損傷,可逆轉(zhuǎn)表觀遺傳學(xué)指標(biāo)的改變,對細(xì)胞的不良反應(yīng)起到一定的拮抗作用;4)充足的葉酸可抑制MNNG對細(xì)胞Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化,從而達(dá)到抑制細(xì)胞不良反應(yīng)的作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：新疆醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R735.1

【參考文獻(xiàn)】

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