發(fā)布時(shí)間：2018-03-01 20:20

  本文關(guān)鍵詞： 肺腺癌 lncRNA RGMB-AS1 RGMB 生長(zhǎng) 遷移 侵襲　出處：《鄭州大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景和目的肺癌根據(jù)臨床治療方案的不同,通常將其分為兩種類型:非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)和小細(xì)胞肺癌(SCLC);前者較為多見,約占肺癌患者比例的80%,近年來,隨著吸煙和各種環(huán)境因素的影響,肺癌的發(fā)病率和死亡率逐年上升,盡管一直以來有關(guān)肺癌的診治水平不斷提高,但肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)速度快、易轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)使得多數(shù)患者總的五年存活率很低。為此,從分子水平探討肺癌的發(fā)生發(fā)展的調(diào)控機(jī)制,早期干預(yù)腫瘤的發(fā)展進(jìn)程,有助于提高肺癌患者的生存率,降低其死亡率。非編碼RNA(Non-coding RNA,nc RNA)生物形成機(jī)制及調(diào)控作用也開始引起研究者的關(guān)注。mi RNA已證實(shí)在轉(zhuǎn)錄或翻譯水平調(diào)控靶基因的表達(dá),進(jìn)而在細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化、增殖、凋亡和細(xì)胞周期等細(xì)胞生物學(xué)行為都起著十分重要的作用。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA,lnc RNA)是一種長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸的非編碼RNA。目前已發(fā)現(xiàn)lnc RNAs在多種癌癥中差異表達(dá),且參與調(diào)控多種分子途徑,引起基因表達(dá)改變,調(diào)控細(xì)胞生物學(xué)行為的變化。為此,lnc RNAs的功能及相關(guān)機(jī)制研究將為腫瘤的治療提供潛在的靶點(diǎn)。Lnc RNA RGMB-AS1定位于5q21.1,目前關(guān)于lnc RNA RGMB-AS1的國(guó)內(nèi)外報(bào)道非常少,結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果肺腺癌標(biāo)本中檢測(cè)分析lnc RNA RGMB-AS1表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)lnc RNA RGMB-AS1在肺腺癌組織中呈高表達(dá),且其表達(dá)水平均與肺腺癌的分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有相關(guān)性,但是lnc RNA RGMB-AS1在肺腺癌中的具體生物學(xué)作用及相關(guān)的分子機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。我們的研究第一次綜合分析了lnc RNA RGMB-AS1在肺腺癌中表達(dá)和生物學(xué)作用,并初步探討了其腫瘤調(diào)節(jié)作用的分子機(jī)制。本研究包括四部分:第一部分:肺腺癌組織中l(wèi)nc RNA RGMB-AS1表達(dá)及與臨床病理學(xué)特征相關(guān)性分析;第二部分:體外調(diào)控lnc RNA RGMB-AS1表達(dá)對(duì)肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和SPC-A-1生長(zhǎng)、遷移和侵襲的影響;第三部分:體內(nèi)調(diào)控lnc RNA RGMB-AS1表達(dá)對(duì)肺腺癌對(duì)裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響;第四部分:lnc RNA RGMB-AS1作用機(jī)制的初步研究。第一部分肺腺癌組織中l(wèi)nc RNA RGMB-AS1表達(dá)及與臨床病理學(xué)特征相關(guān)性分析方法1.收集了110例肺腺癌組織標(biāo)本,包括110例肺腺癌組織和110例配對(duì)的癌旁正常組織標(biāo)本。2.運(yùn)用lnc RNA基因芯片檢測(cè)肺腺癌組織和配對(duì)的癌旁組織標(biāo)本中l(wèi)nc RNA的表達(dá)情況。3.運(yùn)用q RT-PCR檢測(cè)110例標(biāo)本9種lnc RNAs,其中包含5個(gè)在肺腺癌中表達(dá)上調(diào)的lnc RNAs(LOC284801,KIAA1908,XLOC_008466,LINC00665 and RGMB-AS1)和4個(gè)在肺腺癌中表達(dá)下調(diào)的lnc RNAs(MAGI2-AS3,LOC100505495,LOC400550,XLOC_001412)驗(yàn)證lnc RNA芯片結(jié)果的可靠性。4.依據(jù)lnc RNA RGMB-AS1的表達(dá)水平,并分析其與肺腺癌患者年齡、性別、TNM分期、分化程度及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的相關(guān)性。結(jié)果1.lnc RNA芯片檢測(cè)分析得到肺腺癌組織標(biāo)本中差異表達(dá)的lnc RNAs有907個(gè),其中272個(gè)(約30%)表達(dá)上調(diào),635個(gè)(70%)表達(dá)下調(diào)。lnc RNA RGMB-AS1在肺腺癌組織中表達(dá)增高。2.q RT-PCR結(jié)果顯示在9種lnc RNA中,驗(yàn)證結(jié)果和基因芯片結(jié)果一致,證實(shí)了芯片數(shù)據(jù)的可靠性。3.Lnc RNA RGMB-AS1在肺腺癌組織中表達(dá)上調(diào),且相關(guān)性分析結(jié)果顯示lnc RNA RGMB-AS1的表達(dá)水平與肺腺癌分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有相關(guān)性(P0.05),而與病人的年齡和性別無(wú)相關(guān)性(P0.05)。第二部分體外調(diào)控lnc RNA RGMB-AS1表達(dá)對(duì)肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和SPC-A-1生長(zhǎng)、遷移和侵襲的影響方法1.設(shè)計(jì)合成沉默lnc RNA RGMB-AS1表達(dá)的si RNA及無(wú)關(guān)的si RNA序列,分別使用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549和SPC-A-1細(xì)胞。2.熒光定量PCR檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中l(wèi)nc RNA RGMB-AS1的表達(dá)變化,篩選沉默lnc RNA RGMB-AS1表達(dá)效果最佳的si RNA序列。3.CCK-8試劑和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)下調(diào)lnc RNA RGMB-AS1對(duì)A549和SPC-A-1細(xì)胞細(xì)胞增殖能力的影響。4.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)下調(diào)lnc RNARGMB-AS1對(duì)A549和SPC-A-1細(xì)胞周期的影響。5.劃痕實(shí)驗(yàn)用來檢測(cè)下調(diào)lnc RNA RGMB-AS1對(duì)A549和SPC-A-1細(xì)胞遷移能力的影響。6.Transwell實(shí)驗(yàn)用來檢測(cè)下調(diào)lnc RNA RGMB-AS1對(duì)A549和SPC-A-1細(xì)胞侵襲能力的影響。結(jié)果1.對(duì)比空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組,轉(zhuǎn)染lnc RNA RGMB-AS1 si RNA的四個(gè)組中si RNA1(si-lnc RNA組)的沉默作用較為明顯,lnc RNA RGMB-AS1表達(dá)水平顯著下調(diào)(P0.01)。2.CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與對(duì)照組比較,si-lnc RNA組A549和SPC-A-1細(xì)胞的生長(zhǎng)在轉(zhuǎn)染24h后出現(xiàn)顯著抑制(P0.05),并且隨時(shí)間抑制效果日益顯著。3.克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示A549和SPC-A-1細(xì)胞中si-lnc RNA組的細(xì)胞克隆團(tuán)形成明顯少于NC組和Blank組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),說明下調(diào)lnc RNA RGMB-AS1表達(dá),A549和SPC-A-1細(xì)胞的生長(zhǎng)受到顯著抑制。4.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果顯示相比NC組和Blank組,si-lnc RNA組A549和SPC-A-1細(xì)胞處于G0/G1期的細(xì)胞比例顯著增加,而S期細(xì)胞比例顯著減少,進(jìn)一步說明下調(diào)lnc RNA RGMB-AS1表達(dá)可影響A549和SPC-A-1細(xì)胞的生長(zhǎng)。5.劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示si-lnc RNA組A549和SPC-A-1細(xì)胞劃痕的寬度隨時(shí)間延長(zhǎng)愈合較慢,而NC組和Blank組的細(xì)胞劃痕愈合較快,且具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),說明下調(diào)lnc RNA RGMB-AS1表達(dá)可抑制A549和SPC-A-1細(xì)胞的遷移能力。6.Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示si-lnc RNA組A549和SPC-A-1細(xì)胞侵襲數(shù)與Blank組和NC組相比差異有顯著性(P0.05),說明下調(diào)lnc RNA RGMB-AS1表達(dá)可抑制A549和SPC-A-1細(xì)胞的侵襲能力。第三部分體內(nèi)調(diào)控lnc RNA RGMB-AS1表達(dá)對(duì)肺腺癌裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響方法1.設(shè)計(jì)合成針對(duì)lnc RNA RGMB-AS1的sh RNA序列及無(wú)關(guān)陰性對(duì)照sh RNA序列,構(gòu)建慢病毒重組載體后,制備沉默lnc RNA RGMB-AS1表達(dá)的重組慢病毒,感染對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549-Luc和SPC-A-1-Luc細(xì)胞,得到下調(diào)lnc RNA RGMB-AS1表達(dá)的A549-Luc和SPC-A-1-Luc細(xì)胞株。2.熒光定量PCR方法檢測(cè)穩(wěn)定下調(diào)lnc RNA RGMB-AS1表達(dá)的A549-Luc和SPC-A-1-Luc細(xì)胞株中l(wèi)nc RNA RGMB-AS1的表達(dá)水平。3.據(jù)上述lnc RNA RGMB-AS1下調(diào)水平的檢測(cè)結(jié)果將A549-Luc和SPC-A-1-Luc各組處理細(xì)胞注射裸鼠右側(cè)腋下后在1周,2周,3周,4周的時(shí)間運(yùn)用小動(dòng)物成像儀觀察并監(jiān)測(cè)裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)情況。4.免疫組化和Western blot技術(shù)檢測(cè)移植瘤組織中Ki67的表達(dá)水平。結(jié)果1.成功制備了沉默lnc RNA RGMB-AS1表達(dá)的重組慢病毒,到下調(diào)lnc RNA RGMB-AS1表達(dá)的A549-Luc和SPC-A-1-Luc細(xì)胞株。2.在1周,2周,3周,4周的時(shí)間觀察并監(jiān)測(cè)裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)情況,結(jié)果顯示sh RNA1組裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)較空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組明顯減慢,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4周時(shí)的移植瘤體積相比空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組明顯減小,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3.免疫組化和Western blot技術(shù)檢測(cè)移植瘤組織中Ki67的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)顯示sh RNA1組裸鼠移植瘤組織中Ki67的表達(dá)較空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。第四部分lnc RNA RGMB-AS1作用機(jī)制的初步研究方法1.UCSC分析lnc RNA RGMB-AS1序列預(yù)測(cè)可能的靶基因。2.根據(jù)分析結(jié)果構(gòu)建lnc RNA RGMB-AS1第三外顯子的表達(dá)載體(p Silencer3.1-Lnc-Exon3)和RGMB第一和第二外顯子報(bào)告基因載體(p EGFP-N3-Exon1和p EGFP-N3-Exon2),運(yùn)用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分六組進(jìn)行,(1)單獨(dú)轉(zhuǎn)染p EGFP-N3-Exon1;(2)共同轉(zhuǎn)染p EGFP-N3-Exon1和p Silencer 3.1;(3)共同轉(zhuǎn)染p EGFP-N3-Exon1和p Silencer 3.1-Lnc-Exon3;(4)單獨(dú)轉(zhuǎn)染p EGFP-N3-Exon2(5)共同轉(zhuǎn)染p EGFP-N3-Exon2和p Silencer 3.1;(6)共同轉(zhuǎn)染p EGFP-N3-Exon2和p Silencer3.1-Lnc-Exon3。3.運(yùn)用倒置熒光顯微鏡和微量熒光分光光度計(jì)觀察和檢測(cè)各組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。4.q RT-PCR檢測(cè)110例肺腺癌標(biāo)本和對(duì)應(yīng)癌旁正常組織中RGMB m RNA表達(dá)情況并與臨床病理特征和lnc RNA RGMB-AS1進(jìn)行相關(guān)性分析,Western blot技術(shù)檢測(cè)肺腺癌標(biāo)本和對(duì)應(yīng)癌旁正常組織中RGMB蛋白的表達(dá)水平。5.構(gòu)建pc DNA3.1-RGMB表達(dá)載體,運(yùn)用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染A549和SCP-A-1細(xì)胞,western blot技術(shù)檢測(cè)RGMB蛋白的的表達(dá)變化,同時(shí)比較轉(zhuǎn)染lnc RNA RGMB-AS1 si RNA與過表達(dá)RGMB兩細(xì)胞增殖、侵襲和細(xì)胞周期的影響。結(jié)果1.USCS序列分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)lnc RNA RGMB-AS1序列的第三外顯子區(qū)域與RGMB的第一和第二外顯子區(qū)域存在相互作用。2.對(duì)比癌旁正常組織,肺腺癌組織中RGMB m RNA和蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P0.05),經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示肺腺癌組織中RGMB m RNA的表達(dá)水平與肺腺癌分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有相關(guān)性(P0.05),而與病人的年齡和性別無(wú)相關(guān)性(P0.05)。Lnc RNA RGMB-AS1在肺腺癌組織中表達(dá)與RGMB表達(dá)之間呈負(fù)相關(guān)。3.Western blot技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞RGMB蛋白的表達(dá)變化結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染lnc RNA RGMB-AS1相關(guān)的si RNA組RGMB蛋白表達(dá)明顯增加,轉(zhuǎn)染pc DNA3.1-RGMB組細(xì)胞,RGMB蛋白的表達(dá)量也明顯增加,相對(duì)于Blank組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)4.微量熒光分光光度計(jì)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染重組載體p EGFP-N3-Exon1和p Silencer 3.1-Lnc-Exon3的細(xì)胞的熒光強(qiáng)度相對(duì)于單獨(dú)轉(zhuǎn)染p EGFP-N3-Exon1組和共轉(zhuǎn)染p EGFP-N3-Exon1和p Silencer 3.1組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度無(wú)明顯變化(P0.05);而轉(zhuǎn)染重組載體p EGFP-N3-Exon2和p Silencer 3.1-Lnc-Exon3的細(xì)胞的熒光強(qiáng)度相對(duì)于單獨(dú)轉(zhuǎn)染p EGFP-N3-Exon2組和共轉(zhuǎn)染p EGFP-N3-Exon2和p Silencer 3.1組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度明顯減弱(P0.05)。5.CCK8結(jié)果顯示:對(duì)比Blank組,轉(zhuǎn)染后1d后si-lnc RNA組和RGMB過表達(dá)組細(xì)胞的增殖能力均出現(xiàn)明顯抑制(P0.05),并且隨時(shí)間的延長(zhǎng)抑制作用日益顯著。該兩組之間細(xì)胞的增殖能力變化無(wú)顯著差異(P0.05)。6.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果顯示:比Blank組細(xì)胞,si-lnc RNA組和RGMB過表達(dá)組細(xì)胞在G0/G1,S和G2/M期的比例發(fā)生變化,處于G0/G1期比例均顯著升高,而處于S期的比例顯著降低(P0.05),該兩組之間相比無(wú)顯著差異(P0.05)7.Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:對(duì)比Blank組,si-lnc RNA組和RGMB過表達(dá)組細(xì)胞的侵襲能力均出現(xiàn)明顯抑制(P0.05),且比較兩組之間細(xì)胞的侵襲能力變化結(jié)果無(wú)顯著差異(P0.05)結(jié)論1.lnc RNA芯片檢測(cè)分析得到肺腺癌組織標(biāo)本中差異表達(dá)的lnc RNAs有907個(gè),其中272個(gè)(約30%)表達(dá)上調(diào),635個(gè)(70%)表達(dá)下調(diào)。lnc RNARGMB-AS1在肺腺癌組織中表達(dá)增高,其表達(dá)水平與患者的腫瘤分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有相關(guān)性。2.體內(nèi)外下調(diào)肺腺癌細(xì)胞中的lnc RNARGMB-AS1表達(dá)可有效抑制肺腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、抑制細(xì)胞侵襲遷移能力。3.Lnc RNA RGMB-AS1通過負(fù)調(diào)控RGMB的表達(dá),從而發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)功能。4.Lnc RNA RGMB-AS1發(fā)揮促癌作用,有望成為肺腺癌治療新的靶點(diǎn)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R734.2

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本文編號(hào)：1553428