本文關(guān)鍵詞： 固金消瘤湯 非小細(xì)胞肺癌 A549細(xì)胞 BABL/c-nu裸鼠 JAK2/STAT3　出處：《廣州中醫(yī)藥大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:觀察固金消瘤湯治療Ⅲ、Ⅳ期非小細(xì)胞肺癌脾虛痰濕型患者的臨床療效,實(shí)驗(yàn)研究固金消瘤湯的抑瘤功效及其作用機(jī)制,為固金消瘤湯的應(yīng)用提供臨床及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:1.60例Ⅲ、Ⅳ期非小細(xì)胞肺癌脾虛痰濕型患者,隨機(jī)分為中醫(yī)組、西醫(yī)組及中西醫(yī)結(jié)合組,每組各20例。中醫(yī)組予固金消瘤湯(Gujin Xiaoliu Tang,GJXLT),西醫(yī)組予單純化療,中西醫(yī)結(jié)合組予固金消瘤湯聯(lián)合化療。觀察兩周期化療療程,每周期化療前后記錄患者的中醫(yī)癥狀、血液生化、卡氏評分、腫瘤大小等情況,并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。2.按標(biāo)準(zhǔn)方法制備GJXLT含藥血清、GJXLT含藥血清凍干粉及GJXLT凍干粉,分別作用于人肺腺癌A549細(xì)胞模型,MTT比色法檢測細(xì)胞生長抑制率,Annexin V-FITC/PI染色的熒光顯微鏡檢和流式細(xì)胞術(shù)研究GJXLT凍干粉對人A549細(xì)胞的促凋亡作用,Western blot免疫印跡法探討GJXLT對JAK2/STAT3信號通路STAT3、p-STAT3及下游蛋白VEGF表達(dá)的影響。3.腋窩皮下注射A549細(xì)胞懸液以建立BALB/c-nu小鼠移植瘤模型。稱取小鼠體質(zhì)量,隨機(jī)分為模型組、順鉑組、中藥低劑量組、中藥中劑量組及中藥高劑量組。小鼠每日給藥1次,連續(xù)給藥3周,給藥方案為:模型組予生理鹽水灌胃和腹腔注射;順鉑組予生理鹽水灌胃,同時(shí)予順鉑2 mg/(kg·d)腹腔注射;中藥低、中、高劑量組組分別予0.5g/mL、lg/mL、2g/mLGJXLT灌胃,并予生理鹽水腹腔注射。給藥期間觀察小鼠生活狀況,定期測量小鼠移植瘤外觀體積。給藥結(jié)束后稱取小鼠體質(zhì)量,處死小鼠后剝離移植瘤,收集小鼠血液。游標(biāo)卡尺測量剝離瘤體積,DAB免疫組化法測定移植瘤Ki-67核蛋白表達(dá),TUNEL熒光免疫組化法檢測移植瘤細(xì)胞凋亡情況,全自動臨床生化分析儀檢測血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、尿素氮(BUN)及肌酐(Cr)含量,全自動電化學(xué)發(fā)光自動儀檢測肌酸激酶同工酶(CK-MB)含量,三分類血細(xì)胞分析儀檢測紅細(xì)胞(RBC)、白細(xì)胞(WBC)及血小板(PLT)計(jì)數(shù),鏡下觀察檢小鼠肝、腎組織形態(tài)學(xué)改變。成果:1.①臨床實(shí)驗(yàn)完成病例數(shù)35例,中醫(yī)組(A組)8例,中西醫(yī)組12例(B組),西醫(yī)組15例(C組),各組病人年齡、性別及實(shí)驗(yàn)前卡氏評分比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);各組病人病程、病理分型及臨床分期比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。②治療結(jié)束時(shí),B組腫瘤穩(wěn)定例數(shù)高于A組與C組,與A組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.019)。③治療結(jié)束后,A組、B組卡氏評分有升高趨勢(P分別為0.7425、0.0947);C組治療后卡氏評分有降低趨勢(P=0.4025);治療結(jié)束后中西醫(yī)組卡氏評分優(yōu)于中醫(yī)組與西醫(yī)組,與西醫(yī)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.049)。④治療結(jié)束后,B組在咳嗽、氣急、胸痛癥狀的緩解方面比C組有更好的療效,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),三組患者在痰血、咯痰、發(fā)熱、食欲不振、舌質(zhì)舌苔、脈象的方面雖有一定程度的緩解,但3組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。⑤治療結(jié)束后,A組、B組及C組Ⅲ、I度血紅蛋白及血小板減少病例數(shù)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);A組Ⅲ、Ⅳ度白細(xì)胞減少病例數(shù)較C組少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.047)。2.①GJXLT含藥血清作用于A549細(xì)胞48h后,整體抑制率為11.57%(P=0.00010.01);與對應(yīng)濃度的空白血清比較,20%、30%含藥血清組A549細(xì)胞的抑制率分別為16.34%(P=0.00060.01)與 19.72%(P=0.00960.01);②GJXLT含藥血清凍干粉作用于A549細(xì)胞72h后,整體抑制率為22.58%(PP=0.01780.01),與對應(yīng)濃度的空白血清凍干粉比較,6.250%、100%含藥血清凍干粉對A549細(xì)胞的抑制率分別為24.51%(P=0.00620.01)與43.72%(P=0.04890.01);③GJXLT凍干粉作用于A549細(xì)胞 12h、24 h及36h后,與溶劑對照組比較,除12h及24h的GJXLT(8.88ug/ml)組外,各時(shí)間點(diǎn)各濃度GJXLT凍干粉均能抑制A549細(xì)胞的增殖(P0.05),且抑制率具有時(shí)間和濃度依賴性;④倒置熒光顯微鏡下觀察,與溶劑對照組相比,GJXLT凍干粉作用A549細(xì)胞24h后,早期凋亡及晚期凋亡細(xì)胞數(shù)越多,濃度越大,早期及晚期凋亡細(xì)胞數(shù)越多;經(jīng)流式細(xì)胞儀分析,與溶劑對照組相比,早期凋亡率及晚期凋亡率均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=0.385;P=0.0156),兩兩比較,GJXLT高劑量組與空白對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);⑤Western blotting蛋白印跡法檢測結(jié)果表明,GJXLT凍干粉作用于A549細(xì)胞24h后,與溶劑對照組相比,GJXLT(100ug/mL)組P-STAT3蛋白表達(dá)明顯降低(P0.05),余GJXLT濃度組P-STAT3蛋白表達(dá)有降低趨勢(P0.05),呈劑量依賴性效應(yīng);與溶劑對照組組比較,GJXLT(100ug/mL)與GJXLT(50ug/mL)VEGF蛋白表達(dá)明顯降低(P0.05),GJXLT(25ug/mmL)VEGF蛋白表達(dá)有降低趨勢,呈劑量依賴性效應(yīng)。各組STAT 3總蛋白表達(dá)無明顯差異(P0.05)。3.①給藥1周后,模型組小鼠移植瘤體積隨時(shí)間呈指數(shù)式增長、曲線陡直,順鉑組與GJXLT低、中、高劑量組腫瘤生長相對緩慢,曲線較模型組低平;給藥結(jié)束時(shí)與模型組比較,順鉑組及GJXLT中、高劑量組小鼠移植瘤體積明顯較小(P0.05);與順鉑組比較,GJXLT中、高劑量組小鼠移植瘤體積無明顯差異(P0.05)。②給藥結(jié)束后與模型組比較,順鉑組及GJXLT中、高劑量組剝離瘤體積明顯較小(P0.01);與順鉑組比較,GJXLT中、高劑量組剝離瘤體積無明顯差異(P0.05);GJXLT中、高劑量組瘤體積抑制率分別為44.94%、50.87%,高于順鉑組的34.96%。③與空白對照組及順鉑組比較,GJXLT中、高劑量組剝離瘤組織Ki-67蛋白表達(dá)均較弱,陽性細(xì)胞率分別為(44.61 ±8.39)%及(29.94士3.41)%,均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);GJXLT低、中、高劑量組間兩兩比較,部分具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);④TUNEL細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果表明,鏡下觀察GJXLT組剝離瘤組織凋亡細(xì)胞比例較空白對照組及順鉑組高,且隨GJXLT劑量的升高,染為棕色的細(xì)胞(即凋亡細(xì)胞)比例隨之升高。⑤與模型組及順鉑組比較,GJXLT各劑量組裸鼠皮毛光澤,活動靈活,實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)體質(zhì)增加,其中GJXLT高劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與模型組比較,順鉑組裸鼠皮毛欠光澤、反應(yīng)遲鈍、行動遲緩等毒副作用,實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)體重明顯減輕(P0.05)。⑥與模型組比較,順鉑組白細(xì)胞計(jì)數(shù)下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),GJXLT各劑量組白細(xì)胞計(jì)數(shù)無顯著下降(P0.05);與模型組比較,順鉑組及GJXLT高劑量組血小板計(jì)數(shù)上升,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);各組的紅細(xì)胞計(jì)數(shù)均無顯著性差異(P0.05)。⑦與模型組比較,順鉑組谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、尿素氮(BUN)及肌酸激酶同工酶(CK-MB)含量升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),GJXLT各劑量組ALT、AST、BUN及肌酐(Cr)水平無明顯差異(P0.05);與模型組比較,GJXLT中、高劑量組CK-MB水平較低(P0.01)。⑧各組小鼠肝組織切片均未見炎性細(xì)胞浸潤及壞死的病理表現(xiàn),肝細(xì)胞、肝血竇、門管區(qū)組織結(jié)構(gòu)大致正常。與模型組比較,順鉑組肝細(xì)胞胞質(zhì)疏松淡染和氣球樣變,肝細(xì)胞輕度水腫,體積增大,排列稍顯紊亂,部分肝竇受壓和變窄,有肝細(xì)胞輕度變性的表現(xiàn)。⑨各組小鼠腎組織切片均未見炎性細(xì)胞浸潤及壞死的病理表現(xiàn),腎小球、腎小囊、腎小管等組織結(jié)構(gòu)基本正常。結(jié)論:1.固金消瘤湯(GJXLT)配合化療治療Ⅲ、Ⅳ期NSCLC脾虛痰濕型患者,可減少化療副反應(yīng)的發(fā)生,具有提高腫瘤客觀療效、減輕臨床癥狀及提高生存質(zhì)量的作用,臨床應(yīng)用安全,值得推廣。2.GJXLT凍干粉、GJXLT含藥血清及其含藥血清凍干粉能抑制A549細(xì)胞生長,且具有濃度和時(shí)間依賴性。3.GJXLT凍干粉能誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡,可能具有濃度依賴性。4.GJXLT凍干粉可能通過降低p-STAT3及VEGF蛋白表達(dá),抑制JAK2/STAT3信號通路來抑制A549細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。5.GJXLT能通過抑制細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來抑制小鼠A549移植瘤的生長。6.GJXLT能改善A549移植瘤小鼠生存質(zhì)量,無明顯毒副作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R734.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1542052