本文關(guān)鍵詞： 能量代謝調(diào)節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué) 心肌細(xì)胞 心肌成纖維細(xì)胞 高糖 代謝底物 曲美他嗪 糖尿病心肌病 凋亡 纖維化　出處：《山東大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景目前的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明,世界糖尿病患者約1.8億,而到2025年該數(shù)字將增至3.0億。糖尿病是心力衰竭的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,既往的研究表明正常人心力衰竭的發(fā)病率是1%-4%,但是糖尿病患者心衰的發(fā)病率可達(dá)到12%。糖尿病心肌病(Diabetic cardiomyopathy,DCM)是糖尿病代謝異常所引起的特異性心肌病,主要特點(diǎn)為左室擴(kuò)大和室壁運(yùn)動(dòng)減弱,早期主要表現(xiàn)是舒張功能低下,而晚期則表現(xiàn)為收縮功能異常。DCM是糖尿病患者的主要心血管并發(fā)癥之一,也是糖尿病患者心血管疾病的高發(fā)病率和病死率的重要原因。DCM的病因主要包括高血糖、氧化應(yīng)激、心臟自主神經(jīng)病變和胰島素抵抗等,而高血糖在心肌細(xì)胞代謝紊亂中起到了重要的作用。DCM的主要病理變化包括心肌間質(zhì)纖維化,心肌細(xì)胞凋亡和心肌細(xì)胞自噬。心肌間質(zhì)纖維化是成纖維細(xì)胞分泌的膠原在心肌間質(zhì)的過(guò)度沉積,進(jìn)而導(dǎo)致了心臟松弛性的降低和僵硬度的提高,進(jìn)而影響心功能。心肌細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的一種程序性死亡,是DCM心肌細(xì)胞丟失的主要原因。高糖狀態(tài)可以引起細(xì)胞代謝紊亂,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體受損,從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡,由于心肌是不可增殖的永久細(xì)胞,所以心肌凋亡可導(dǎo)致心肌收縮能力的減低。自噬是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)大分子和細(xì)胞器降解和循環(huán)利用的主要代謝通路,自噬功能受損將引起錯(cuò)誤折疊蛋白和破損細(xì)胞器的積聚,導(dǎo)致細(xì)胞死亡。正常成人的心臟代謝主要來(lái)自兩部分:60%～70%的脂肪酸β氧化和20%～25%的葡萄糖氧化。研究證實(shí),在糖尿病狀態(tài)下,脂肪酸β氧化和葡萄糖氧化的比例將拉大,脂肪酸β氧化顯著上升而葡萄糖氧化進(jìn)一步降低。脂肪酸氧化可產(chǎn)生大量脂質(zhì)中間體,其累積在心肌細(xì)胞中最終導(dǎo)致心功能受損。脂肪酸還損傷心肌細(xì)胞的鈣離子調(diào)節(jié),導(dǎo)致心肌收縮功能受損;而且脂肪酸氧化會(huì)增加活性氧的產(chǎn)生,過(guò)多的脂肪酸氧化將引起活性氧的積聚,導(dǎo)致氧化應(yīng)激,從而對(duì)心肌細(xì)胞產(chǎn)生損害。研究證實(shí)恢復(fù)代謝的正常比例可恢復(fù)心功能,但是具體的作用機(jī)制不明,其是否可調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞凋亡、心肌細(xì)胞自噬和心肌間質(zhì)纖維化還有待探討。在本實(shí)驗(yàn)中,我們將運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),給予代謝調(diào)節(jié)劑曲美他嗪(Trimetazidine,TMZ),研究能量代謝轉(zhuǎn)變對(duì)于高糖誘導(dǎo)下心肌細(xì)胞的蛋白作用,以及對(duì)高糖誘導(dǎo)下心肌細(xì)胞和心肌成纖維細(xì)胞分泌蛋白的作用,探討能量代謝轉(zhuǎn)變后差異蛋白與心肌細(xì)胞凋亡和自噬的相關(guān)性,以及和成纖維細(xì)胞膠原分泌的關(guān)系,并分析其可能機(jī)制,為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)提供理論基礎(chǔ)。研究目的1.探討能量代謝轉(zhuǎn)變對(duì)高糖誘導(dǎo)下心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分泌蛋白及心肌細(xì)胞蛋白的作用;2.探討能量代謝轉(zhuǎn)變后三種不同來(lái)源的差異蛋白與能量代謝、心肌凋亡、心肌自噬和心肌間質(zhì)纖維化的關(guān)系,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供基礎(chǔ);3.探討能量代謝轉(zhuǎn)變后三種不同來(lái)源的差異蛋白與心肌細(xì)胞凋亡、心肌細(xì)胞自噬和心肌間質(zhì)纖維化關(guān)鍵調(diào)節(jié)通路的關(guān)系,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供基礎(chǔ)。研究方法1.實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕⒈狙芯恳栽囵B(yǎng)的新生大鼠心肌細(xì)胞(Neonatal rat ventricular myocytes,NRVM)、H9c2大鼠心肌細(xì)胞系和原代培養(yǎng)的新生小鼠心肌成纖維細(xì)胞(Cardiac fibroblasts,CF)為研究對(duì)象,分成對(duì)照組、高糖組和TMZ干預(yù)組3組,對(duì)照組給予低糖(5.5mmol/L)+甘露醇(27.5mmol/L)刺激,高糖組給予葡萄糖(33mmol/L)刺激,TMZ干預(yù)組給予TMZ(10μmol/L)+高糖(33mmol/L)刺激,分別孵育三種細(xì)胞,進(jìn)而收集H9c2細(xì)胞、NRVM培養(yǎng)基和CF培養(yǎng)基。2.蛋白的收集無(wú)血清培養(yǎng)基中,高糖刺激NRVM和CF 24h,收取上清,濃縮離心管離心,為下一步樣品處理做準(zhǔn)備。高糖刺激H9c2細(xì)胞24h,PBS沖洗后,刮取細(xì)胞,多次離心去除血清影響。3.樣品處理,質(zhì)譜及數(shù)據(jù)分析向收取的細(xì)胞中加入細(xì)胞裂解液,結(jié)合超聲波破碎細(xì)胞,應(yīng)用Bradford蛋白質(zhì)定量法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度,隨后經(jīng)過(guò)TCEP還原,IDA烷基化,胰酶消化,C18除鹽,Nanodrop測(cè)定蛋白濃度,TMT標(biāo)記蛋白肽段或者無(wú)標(biāo)記蛋白定量,最后樣品應(yīng)用Q-Exactive質(zhì)譜儀進(jìn)行分析。使用Proteome Discoverer 1.4進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)收索;采用GO分類工具對(duì)鑒定的蛋白進(jìn)行分子功能分類與生物進(jìn)程分類;應(yīng)用Ingenuity Pathways Analysis(IPA)軟件進(jìn)行通路分析。結(jié)果1.質(zhì)譜分析結(jié)果經(jīng)過(guò)ESI-MS/MS鑒定并通過(guò)SEQUEST搜索對(duì)比,心肌細(xì)胞結(jié)果共鑒定出1235種蛋白,對(duì)照組與高糖組的差異蛋白為161種,其中123種蛋白發(fā)生上調(diào),38種蛋白下調(diào);經(jīng)過(guò)TMZ干預(yù)后,上調(diào)蛋白中84種蛋白發(fā)生回調(diào),29種下調(diào)蛋白升高。NRVM培養(yǎng)基共鑒定121種蛋白,高糖組與對(duì)照組相比的差異蛋白為26種,其中14種蛋白發(fā)生上調(diào),12種蛋白下調(diào);經(jīng)過(guò)TMZ干預(yù)后,7種上調(diào)蛋白發(fā)生回調(diào),2種下調(diào)蛋白發(fā)生回調(diào)。CF培養(yǎng)基共鑒定出1415種蛋白,對(duì)照組與糖組的差異蛋白為218種,其中47種蛋白發(fā)生上調(diào),171種蛋白發(fā)生下調(diào);經(jīng)過(guò)TMZ干預(yù)后,其中17種上調(diào)蛋白發(fā)生回調(diào),163種下調(diào)蛋白發(fā)生回調(diào)。2.TMZ干預(yù)后高糖誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞差異蛋白表達(dá)譜分析與高糖組相比,按照差異蛋白定位分類,TMZ干預(yù)組差異蛋白主要包括胞漿蛋白(46.9%),大分子復(fù)合物(14.3%)和細(xì)胞器蛋白(26.55%)等;按照蛋白的功能分類,TMZ干預(yù)組的差異蛋白主要包括具有催化活性蛋白(45.3%),結(jié)合活性蛋白(32.6%)和結(jié)構(gòu)分子活性蛋白(14.0%)等。通過(guò)對(duì)差異蛋白的分析,差異蛋白中與能量代謝相關(guān)的蛋白主要包括果糖二磷酸醛縮酶(Aldolase A,Fructose-bisphosphate,Aldoa)、6-磷酸葡萄糖脫氫酶(6-phosphogluconate dehydrogenase,G6pd)、細(xì)胞色素 b-cl 復(fù)合體亞基1(Cytochrome b-cl complex subunit 1,mitochondrial,Uqcrcl)等。與凋亡相關(guān)的蛋白主要包括胞漿精氨酸-tRNA連接酶(Arginine--tRNA ligase,cytoplasmic,Rars)、絲氨酸蛋白酶(Serine protease,HTRA1)等。與自噬相關(guān)的蛋白包括泛素樣蛋白激活酶1(Ubiquitin-like modif-ier-activating enzyme 1,Ubal),Hsp90ab1 和 Stat1 等。與pi3k/AKT通路相關(guān)的蛋白主要包括粘著斑蛋白(Vinculin,Vcl)、解聚蛋白(Destrin,Dstn)、ADP 核糖基化因子 4(ADP-ribosylation factor 4,Arf4)、Arhgdia、Stat1、Gdi2等;與AMPK相關(guān)的蛋白包括三功能性酶亞基α(Trifunctional enzyme subunit alpha,mitochondrial,Hadha)、線粒體延胡索酸酯酶(Fumaratehydratase,Fh)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(Aspartate aminotransferase,mitochondria,Got2)。3.TMZ干預(yù)后高糖誘導(dǎo)下心肌細(xì)胞差異分泌蛋白表達(dá)譜分析與對(duì)照組相比,根據(jù)差異蛋白參與的生物過(guò)程分類,高糖組分泌的差異蛋白主要包括生物調(diào)節(jié)蛋白(5.7%)、細(xì)胞成分調(diào)節(jié)蛋白(8.6%)、細(xì)胞過(guò)程調(diào)節(jié)蛋白(31.4%)、發(fā)育調(diào)節(jié)蛋白(8.6%)、定位調(diào)節(jié)蛋白(8.6%)、代謝調(diào)節(jié)蛋白(22.9%)、多細(xì)胞生物過(guò)程調(diào)節(jié)蛋白(8.6%)和刺激反應(yīng)蛋白(5.7%);TMZ干預(yù)后,參與生物學(xué)過(guò)程的差異蛋白組成轉(zhuǎn)變?yōu)樯镎{(diào)節(jié)蛋白(12.5%)、細(xì)胞成分調(diào)節(jié)蛋白(6.3%)、細(xì)胞過(guò)程調(diào)節(jié)蛋白(25%)、發(fā)育調(diào)節(jié)蛋白(12.5%)、定位調(diào)節(jié)蛋白(6.3%)、代謝調(diào)節(jié)蛋白(25%)、多細(xì)胞生物過(guò)程調(diào)節(jié)蛋白(6.3%)和刺激反應(yīng)蛋白(6.3%)。與對(duì)照組相比,根據(jù)差異蛋白的功能分類,高糖組心肌細(xì)胞分泌的差異蛋白包括催化活性蛋白(47.6%)、結(jié)合活性蛋白(28.6%)和結(jié)構(gòu)分子活性蛋白(23.8%);與高糖組相比,TMZ干預(yù)組心肌細(xì)胞分泌的差異蛋白包括催化活性蛋白(37.5%)、結(jié)合活性蛋白(37.5%)和結(jié)構(gòu)分子活性蛋白(25%)。經(jīng)過(guò)蛋白質(zhì)相互作用分析,與高糖組相比,TMZ干預(yù)組大鼠心肌細(xì)胞分泌的差異蛋白和凋亡相關(guān)的蛋白包括膜聯(lián)蛋白A7(annexin A7,Anxa7)和四個(gè)半LIM 域蛋白 2(four and a half LIM domains protein 2,Fhl2)等。與pi3k/AKT信號(hào)通路相關(guān)的蛋白是解離抑制蛋白(rho GDP-dissociation inhibitor 2,Gdi2)。4.TMZ干預(yù)后高糖誘導(dǎo)下成纖維細(xì)胞分泌的差異蛋白表達(dá)譜分析與對(duì)照組相比,根據(jù)差異蛋白的功能分類,高糖組成纖維細(xì)胞分泌的差異蛋白包括細(xì)胞結(jié)合活性蛋白(39.70%)、受體活性蛋白(5.80%)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性蛋白(3.30%)、抗氧化活性蛋白(0.80%)和轉(zhuǎn)運(yùn)活性蛋白(5.80%);與高糖組相比,TMZ干預(yù)組的差異蛋白包括結(jié)合活性蛋白(38.80%)、受體活性蛋白(7.10%)、結(jié)構(gòu)分子活性蛋白(4.30%)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性蛋白(4.10%)、催化活性蛋白(38.80%)、抗氧化活性蛋白(1.00%)和轉(zhuǎn)運(yùn)活性蛋白(5.10%)。與對(duì)照組相比,根據(jù)差異蛋白參與的生物學(xué)過(guò)程分類,高糖誘導(dǎo)組成纖維細(xì)胞分泌的差異蛋白包括生物調(diào)節(jié)蛋白(4.90%)、定位調(diào)節(jié)蛋白(5.30%)、復(fù)制調(diào)節(jié)蛋白(1.50%)、多細(xì)胞生物過(guò)程調(diào)節(jié)蛋白(5.8%)、刺激反應(yīng)蛋白(6.00%)、生物附著調(diào)節(jié)蛋白(6.00%)、多細(xì)胞組分或合成調(diào)節(jié)蛋白(6.40%)、免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白(6.80%)、發(fā)育調(diào)節(jié)蛋白(7.90%)、代謝相關(guān)蛋白(20.00%)和細(xì)胞過(guò)程調(diào)節(jié)蛋白(29.40%);TMZ干預(yù)后,與高糖組相比,成纖維細(xì)胞分泌的差異蛋白主要包括生物調(diào)節(jié)蛋白(6.10%)、定位調(diào)節(jié)蛋白(5.70%)、復(fù)制調(diào)節(jié)蛋白(1.90%)、多細(xì)胞組分或合成調(diào)節(jié)蛋白(5.70%)、刺激反應(yīng)蛋白(7.10%)、生物附著調(diào)節(jié)蛋白(5.20%)、多細(xì)胞生物過(guò)程調(diào)節(jié)蛋白(6.10%)、免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白(5.20%)、發(fā)育調(diào)節(jié)蛋白(8.00%),代謝調(diào)節(jié)蛋白(19.80%)和細(xì)胞過(guò)程調(diào)節(jié)蛋白(29.20%)。經(jīng)過(guò)蛋白質(zhì)相互作用分析,TMZ干預(yù)組分泌的差異蛋白和能量代謝相關(guān)的蛋白包括肌酸激酶(creatine kinase,mitochondrial 2,Ckmt2)、染色體-解旋-DNA-結(jié)合蛋白 7(Chromodomain-helicase-DNA-binding protein7,Chd7)和 Aldoa 等與凋亡相關(guān)的蛋白包括基因絲動(dòng)力重鏈蛋白8(axonemal dynein heavy chain 8,Dnahc8)、Trafl和 Sox5 等。與自噬相關(guān)的蛋白關(guān)包括Dapk 1和Zc3h 12d,而與mTOR相關(guān)的包括Dnahc8和 Smad5。與膠原分泌相關(guān)的蛋白包括非肌肉αα-肌動(dòng)蛋白(non-muscle alpha-actinin 4,Actn4)和 p58/GTA 蛋白激酶(p58/GTA protein kinase,Cdk1 1b)等經(jīng)過(guò)相互作用分析,核苷二磷酸激酶(Nucleoside diphosphate kinase,Gm20390)以及Ppard與AMPK信號(hào)通路存在相互作用關(guān)系;與piβK/AKT信號(hào)通路相關(guān)是磷酯酶Cβ1(phospholipase C beta 1,Plcb1)和肌微管素同源蛋白2(myotubularin homologous protein 2,Mtmr2)等;與 AKT 信號(hào)通路存在相互關(guān)系的蛋白為Fanconi貧血蛋白(Fanconi anemia protein,Fanca)和結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(Connective tissue growth factor,Ctgf)等。經(jīng)過(guò)蛋白相互作用分析,與MAPK存在相互作用的蛋白包括Smad5、Mapkapk5、parp1、Traf1、Ppard、Dapk1、Plcb1、Grik2、Dnahc8 和 Kcnh8。5.TMZ干預(yù)對(duì)高糖誘導(dǎo)下心肌細(xì)胞中炎癥相關(guān)蛋白的影響經(jīng)過(guò)IPA軟件進(jìn)行分析,與高糖組相比,TMZ干預(yù)組中有18種差異蛋白與炎癥相關(guān),其中包括膜聯(lián)蛋白A3(Annexin A3)、腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Adenine phosphoribosyltransferase,APRTase)、RNA 解螺旋酶 p68(DEAD(Asp-Glu-Ala-Asp)和細(xì)絲蛋白 A(Filamin alpha,FLNA)等。6.TMZ干預(yù)對(duì)高糖誘導(dǎo)下心肌細(xì)胞中ROS相關(guān)蛋白的影響經(jīng)過(guò)IPA軟件進(jìn)行分析,與高糖組相比,TMZ干預(yù)組中有12種差異蛋白涉及氧化應(yīng)激的調(diào)控過(guò)程,其中包括G6PD、硫氧還蛋白(Thioredoxin)、17β-羥基類固醇脫氫酶(17-β-Hydroxysteroid dehydrogenase,HSD10)、熱休克蛋白 90β(Heat shock protein HSP 90-beta,HSP90beta)和硫氧還蛋白依賴性過(guò)氧化物還原酶(Peroxiredoxin 3,PRX 3)等。7.TMZ干預(yù)對(duì)高糖誘導(dǎo)下心肌細(xì)胞中與心肌肥厚相關(guān)調(diào)控蛋白的影響經(jīng)過(guò)IPA軟件進(jìn)行分析,與高糖組相比,TMZ干預(yù)組中有9種差異蛋白與心肌肥厚的調(diào)控過(guò)程相關(guān),其中包括腺苷酸環(huán)化酶相關(guān)蛋白1(Adenylyl cyclase-associated protein 1,CAP1)、二氫嘧啶相關(guān)蛋白 3(Dihydropyrimidinase-related p-rotein 3,DPYL3)、溶酶體膜蛋白 2(Lysosome membrane protein 2,LIMP-2)和膜突蛋白(Moesin)等。結(jié)論1.能量代謝調(diào)節(jié)后,高糖誘導(dǎo)下的心肌細(xì)胞中有84種差異蛋白發(fā)生回調(diào);高糖誘導(dǎo)下心肌細(xì)胞分泌的差異蛋白中有26種發(fā)生回調(diào);高糖誘導(dǎo)下心肌成纖維細(xì)胞分泌的差異蛋白中有218種發(fā)生回調(diào),提示能量代謝調(diào)節(jié)對(duì)高糖刺激的干預(yù)十分廣泛;2.回調(diào)的差異蛋白與代謝、心肌凋亡、心肌自噬和心肌成纖維分泌膠原密切相關(guān),提示代謝改變可能在高糖條件下調(diào)節(jié)以上過(guò)程,為進(jìn)一步研究提供了基礎(chǔ);3.回調(diào)的差異蛋白與代謝相關(guān)通路PI3K/AKT、纖維化相關(guān)通路MAPKs以及凋亡和自噬關(guān)鍵通路AMPK密切相關(guān),提示代謝調(diào)節(jié)可能通過(guò)上述信號(hào)通路對(duì)心肌細(xì)胞和心肌成纖維細(xì)胞發(fā)揮作用。研究背景隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展以及生活水平的日益提高,人們不健康的生活方式以及飲食習(xí)慣成為糖尿病發(fā)病的主要誘因。據(jù)世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù),2025年全球糖尿病人口預(yù)計(jì)將增加至3億,糖尿病已經(jīng)成為威脅全球人類健康的最重要的非傳染性疾病之一,其造成的社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)以及對(duì)人類健康的影響是世界范圍共同面臨的嚴(yán)峻問(wèn)題,約有一半的糖尿病患者死于心血管并發(fā)癥。糖尿病心肌病(Diabetic Cardiomyopathy,DCM)是糖尿病患者發(fā)生心力衰竭和粹死的主要原因,其主要表現(xiàn)為早期無(wú)癥狀的舒張功能受損,進(jìn)而表現(xiàn)為收縮功能受損,最終發(fā)展為有癥狀的充血性心力衰竭。由于目前糖尿病心肌病患者的不斷增加,繼續(xù)探尋DCM的有效治療藥物具有重要意義。糖尿病心肌病(DCM)作為一種代謝性心肌病,其發(fā)病不依賴于冠心病、高血壓、瓣膜病以及其他可以導(dǎo)致心功能障礙的心臟疾病。目前DCM的藥物治療主要包括磺脲類、二甲雙胍、噻唑烷二酮類(Thiazolidinediones,TZDs)、胰島素、二肽基肽酶Ⅳ(Dipeptidyl peptidas'e-4,DPP-4)抑制劑、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(Renin-angiotensin-aldosterone System,RAAS)抑制劑、血管緊張素受體阻斷劑(Angiotensin Receptor Blockers,ARBs)和β受體阻滯劑,但是相關(guān)回顧性研究表明,很多類型的糖尿病治療藥物,如磺脲類、TZDs和胰島素等在改善心衰方面均無(wú)明顯作用。最近的研究發(fā)現(xiàn)強(qiáng)化血糖治療方法對(duì)于DCM的死亡率也無(wú)任何影響。流行病學(xué)研究表明DCM的發(fā)病率仍在不斷增加,提示目前針對(duì)DCM的治療方法效果不佳。DCM的發(fā)病存在亞臨床階段,因此DCM的診斷極易被忽視以及延誤,針對(duì)DCM的預(yù)防顯得尤為重要。以上的研究表明亟需一種新的針對(duì)DCM的預(yù)防和治療的方法。糖尿病相關(guān)的心臟能量代謝紊亂在DCM的發(fā)病過(guò)程中起到了重要作用,其特點(diǎn)為脂肪酸β氧化增加和糖代謝減少。既往的研究證實(shí)脂肪酸β氧化可增加自由基的產(chǎn)生,其進(jìn)一步的積聚引起氧化應(yīng)激,從而導(dǎo)致DCM的發(fā)生發(fā)展。過(guò)度的脂肪酸代謝還可降低跨肌漿網(wǎng)鈣離子流,損傷心肌收縮,進(jìn)而影響心功能;過(guò)度的脂肪酸代謝還可抑制糖的利用,進(jìn)一步損傷糖代謝。研究表明心肌代謝底物的改變遠(yuǎn)早于DCM的發(fā)生,提示代謝底物可能是DCM的啟動(dòng)因素。基于以上研究,恢復(fù)脂肪酸β氧化和糖代謝的正常比例,可能開(kāi)辟出DCM治療的新方向。DCM的主要發(fā)病機(jī)制包括心肌間質(zhì)纖維化,心肌細(xì)胞凋亡和心肌細(xì)胞自噬。心肌間質(zhì)纖維化是細(xì)胞外基質(zhì)在心肌間質(zhì)的過(guò)度沉積,進(jìn)而導(dǎo)致了心臟松弛性的降低和僵硬度的提高,進(jìn)而影響心功能。心肌細(xì)胞的凋亡是細(xì)胞的程序性死亡,研究表明在糖尿病狀態(tài)下,心肌細(xì)胞的凋亡比非糖尿病狀態(tài)增加85倍,由于心肌細(xì)胞不可增殖,心肌細(xì)胞數(shù)目的減少將導(dǎo)致有效收縮單位減少,進(jìn)一步影響心功能。自噬為細(xì)胞內(nèi)降解及循環(huán)利用蛋白、脂質(zhì)及細(xì)胞器等的機(jī)制,自噬功能紊亂可影響心肌功能,從而也可影響心功能。我們第一部分蛋白質(zhì)組學(xué)的研究結(jié)果表明代謝調(diào)節(jié)可對(duì)心肌成纖維細(xì)胞的分泌蛋白、心肌細(xì)胞的蛋白及其分泌蛋白的表達(dá)水平產(chǎn)生重大影響,而這些差異蛋白的表達(dá)與心肌細(xì)胞凋亡、心肌細(xì)胞自噬和心肌間質(zhì)纖維化密切相關(guān),提示我們代謝調(diào)節(jié)可能通過(guò)對(duì)此三個(gè)過(guò)程產(chǎn)生作用,從而調(diào)控DCM的發(fā)展。綜上所述,我們提出如下假說(shuō):早期促進(jìn)脂肪酸β氧化向葡萄糖氧化的轉(zhuǎn)變,可以部分預(yù)防DCM,機(jī)制主要可能是通過(guò)調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞凋亡、心肌細(xì)胞自噬和心肌間質(zhì)纖維化來(lái)實(shí)現(xiàn)的。在本實(shí)驗(yàn)中,我們建立了 2型糖尿病大鼠模型并給予代謝調(diào)節(jié)劑曲美他嗪干預(yù),旨在探討早期代謝底物轉(zhuǎn)變對(duì)DCM的作用。研究目的1.建立2型糖尿病大鼠的DCM模型,研究心臟脂肪酸氧化向葡萄糖氧化的轉(zhuǎn)變對(duì)DCM的作用;2.探討能量代謝謝調(diào)節(jié)在DCM大鼠模型中對(duì)心臟結(jié)構(gòu)以及心功能情況的影響;3.研究能量代謝調(diào)節(jié)在DCM大鼠模型中對(duì)心肌間質(zhì)纖維化、心肌細(xì)胞凋亡和自噬的作用;探討其是否通過(guò)PI3K/AKT、MAPKs及AMPK/Bcl-2-Beclin1信號(hào)通路發(fā)揮心臟保護(hù)作用。研究方法1.2型糖尿病大鼠動(dòng)物模型的建立18只體重120g-140g的雄性SD大鼠(約5周齡),適應(yīng)性喂養(yǎng)(普通飼料和水)1周后將其隨機(jī)分為2組,對(duì)照組(Control組,n=6)和糖尿病組(DM組,n=12),對(duì)SD大鼠行基礎(chǔ)水平胰島素耐量檢測(cè)(IPITT)和空腹葡萄糖耐量檢測(cè)(IPGTT)。Control組大鼠喂以基礎(chǔ)飼料,DM組大鼠喂以高糖高脂高熱量飼料。4周后再次行IPITT和IPGTT,將DM組出現(xiàn)胰島素抵抗(Insulin resistance,IR)的大鼠一次性給予腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ,27.5mg/kg)。各組大鼠繼續(xù)喂養(yǎng)原飼料1周,隨后檢測(cè)DM組大鼠的空腹血糖(FBG)及空腹胰島素(FINS)水平,并計(jì)算胰島素敏感指數(shù)(ISI)(公式In[(FINSxFBG)-1])。將連續(xù)2次空腹血糖≥11.1mmol/L的大鼠納入實(shí)驗(yàn)。隨后將DM組隨機(jī)分為2個(gè)亞組:DM組(n=6)和DM+TMZ組(n=6),TMZ(30mg/kg/day)灌胃8周后,處死大鼠,留取標(biāo)本。2.腹腔葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)(IPGTT)及胰島素耐量實(shí)驗(yàn)(IPITT)IPGTT:大鼠禁食12h后經(jīng)尾靜脈取血測(cè)定血糖,隨后經(jīng)腹腔注射葡萄糖(1g/kg),分別在注射葡萄糖15min,30min,60min,120min后,于尾靜脈取血,使用強(qiáng)生穩(wěn)步血糖儀監(jiān)測(cè)血糖變化,并通過(guò)血糖結(jié)果計(jì)算血糖曲線下面積(AUC)。IPITT:大鼠禁食4h后經(jīng)尾靜脈取血測(cè)定血糖,隨后經(jīng)腹腔注射胰島素(1unit/kg),血糖測(cè)定時(shí)間點(diǎn)、測(cè)定方法以及AUC的計(jì)算同IPGTT。3.血液學(xué)指標(biāo)檢測(cè)于實(shí)驗(yàn)0周、4周、5周、13周時(shí)取血進(jìn)行血液生化分析。大鼠取血前禁食12h,然后于頸靜脈竇處取血1ml,離心分離血清后,運(yùn)用Bayerl650血生化分析儀檢測(cè)血糖(FBG)、總膽固醇(TC)及甘油三酯(TG)。運(yùn)用酶聯(lián)免疫法測(cè)定空腹胰島素水平(FINS)。4.血壓和心率監(jiān)測(cè)使用無(wú)創(chuàng)大鼠尾動(dòng)脈血壓測(cè)量?jī)x測(cè)量大鼠收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)、平均動(dòng)脈壓(MAP)以及心率(HR),每只大鼠測(cè)量3次,取平均值。5.心導(dǎo)管檢測(cè)戊巴比妥鈉(2.5%)麻醉下,行心導(dǎo)管檢測(cè)。開(kāi)胸后將導(dǎo)管從左心室心尖處插入,記錄左室舒張末壓(LVEDP)和收縮壓(LVSP)。6.留取組織學(xué)標(biāo)本將大鼠心臟取出,其中一部分放入多聚甲醛(4%)中,固定1-2周后,石蠟包埋,切為4.5um厚的組織切片。另一部分左室心肌組織凍于-80℃冰箱中,以備 Western blotting 使用。7.組織和形態(tài)學(xué)分析石蠟切片進(jìn)行HE染色,Masson染色和天狼星紅染色,分別顯示心臟的大體形態(tài)和纖維化程度。8..心肌細(xì)胞調(diào)亡的檢測(cè)TUNEL法檢測(cè)左室心肌細(xì)胞的調(diào)亡水平。9.免疫組織化學(xué)染色石蠟切片滴加兔抗大鼠Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ—抗,4℃過(guò)夜后,滴加山羊抗兔二抗,DAB顯色,蘇木素復(fù)染。結(jié)果顯示心肌組織Collagen Ⅰ、Ⅲ的分布和表達(dá)水平。圖片處理與分析采用Image-Pro Plus 5.0軟件。10.Westernblotting 實(shí)驗(yàn)提取大鼠左室心肌組蛋白,測(cè)定濃度,應(yīng)用Western blotting檢測(cè)其中p-AMPK,t-AMPK,Caspase 3,PARP,p-ERK,t-ERK,p-P38,t-P38,p-JNK,t-JNK,p-PI3 K,t-PI3K,p-AKT,t-AKT,ATG5 和 ATG7 的蛋白表達(dá)水平13.統(tǒng)計(jì)分析計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較兩組間的差異,采用one-way ANOVA比較多組間的均數(shù)。所有的統(tǒng)計(jì)過(guò)程均通過(guò)統(tǒng)計(jì)軟件SPSS16.0完成,以p0.05作為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1.TMZ改善2型糖尿病大鼠的代謝紊亂實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:FBG及FINS在4周時(shí)開(kāi)始升高,TG在5周時(shí)開(kāi)始升高,實(shí)驗(yàn)?zāi)〥M組TC、TG、FBG和FINS明顯升高。給予TMZ干預(yù)后,與DM組相比,DM+TMZ 組 TC、TG、FBG 及 FINS 均明顯降低(p0.05)。2.TMZ改善DCM大鼠葡萄糖耐量和胰島素敏感性高脂喂養(yǎng)4周后,行IPGTT及IPITT檢測(cè)。IPGTT結(jié)果顯示,與基線水平相比,DM組大鼠Omin和30min時(shí)的血糖水平明顯升高(p0.05),曲線下面積(AUC)明顯增加(p0.05)。IPITT結(jié)果顯示各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血糖水平均較基線水平明顯升高(p0.05),AUC也明顯增加(p0.05);實(shí)驗(yàn)?zāi)?與DM組大鼠相比,DM+TMZ組的IPGTT和IPITT結(jié)果表明該組大鼠的血糖水平及AUC均明顯降低(p0.05),顯示TMZ干預(yù)可以提高糖尿病大鼠葡萄糖耐量以及增加胰島素敏感性。3.TMZ改善DCM大鼠的左室重構(gòu)DM組大鼠心臟較Control組心臟明顯增大,心臟重量/體重(HW/BW)明顯提高(3.39 ±0.07 vs.2.51 ±0.05,p0.05),HE染色顯示左室室壁增厚,肌纖維排列紊亂,間隙疏松,并可見(jiàn)肌纖維斷裂;給予TMZ治療后,DM+TMZ組大鼠較DM組大鼠心臟稍微變小,HW/BW明顯減小(2.88 ±0.09 vs.3.39 ±0.07,P0.05),室壁變薄,肌纖維排列相對(duì)致密且有序。4.TMZ改善DCM大鼠的心肌間質(zhì)纖維化Masson染色及天狼猩紅染色顯示DM組較Control組肌纖維排列疏松,間質(zhì)和血管周?chē)嬖诖罅咳緸樗{(lán)綠色的膠原纖維,左室心肌組織膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF%)和血管周?chē)w維化指數(shù)(PVCA/LA)明顯增加(p0.05)。給予TMZ治療后,與DM組相比,DM+TMZ組肌纖維排列較致密,間質(zhì)和血管周?chē)嬖诘哪z原纖維明顯減少,CVF%和(PVCA/LA)明顯下降(p0.05)。免疫組化半定量結(jié)果顯示相對(duì)于Control組,DM組心肌組織膠原Ⅰ/Ⅲ的表達(dá)明顯增加(p0.05),而給予TMZ治療后,心肌組織膠原Ⅰ/Ⅲ的表達(dá)明顯降低。5.TMZ抑制DCM大鼠的心肌細(xì)胞凋亡Tunel染色顯示DM組較Control組的心肌細(xì)胞Tunel陽(yáng)性細(xì)胞明顯增加(p0.05),Western結(jié)果顯示cleaved Caspase和Parp的表達(dá)同樣顯著增加(p0.05)。給予TMZ治療后,Tunel陽(yáng)性細(xì)胞顯著降低(p0.05),而cleaved Caspase和Parp的表達(dá)也顯著降低(p0.05)。6.TMZ提高DCM大鼠的心肌細(xì)胞的自噬功能Western結(jié)果顯示DM組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值與Control組相比明顯降低(p0.05),并且ATG5和ATG7表達(dá)明顯降低(p0.05);給予TMZ治療后,DM+TMZ組較DM組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值明顯增加,ATG5和ATG7表達(dá)明顯升高(p0.05)。7.TMZ改善了 DCM大鼠心功能實(shí)驗(yàn)?zāi)?有創(chuàng)心導(dǎo)管法的結(jié)果表明,DM組較Control組的舒張末期左室內(nèi)壓力增加,收縮壓降低(p0.05);給予TMZ治療之后,DM+TMZ組較DM組舒張末期左室內(nèi)壓力明顯下降(p0.05),該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明TMZ可以有效改善DCM大鼠的左室舒張功能。8.TMZ 對(duì)于 PI3K/AKT,MAPKs 和 AMPK/Beclin1-Bcl2 信號(hào)通路的調(diào)節(jié)Western結(jié)果表明,與Control組相比,DM組PI3K/AKT通路中的p-PI3K和p-AKT蛋白水平明顯降低(p0.05),MAPK通路中的p-ERK、p-P38和p-JNK蛋白水平明顯增加(p0.05),通路中的p-AMPK蛋白水平明顯降低(p0.05),Beclin1-Bcl2的結(jié)合明顯增加(p0.05)。給予TMZ治療后,DM+TMZ組較DM組p-PI3K和p-AKT水平明顯升高(p0.05),p-ERK、和p-P38蛋白水平明顯增加而p-JNK無(wú)明顯改變,p-AMPK蛋白水平明顯降低(p0.05),Beclin 1-Bcl2的結(jié)合明顯增加(p0.05)。結(jié)論1.早期代謝調(diào)節(jié)可部分預(yù)防DCM的發(fā)生和發(fā)展;2.早期代謝調(diào)節(jié)可以通過(guò)減輕2型糖尿病大鼠的心肌間質(zhì)纖維化、心肌細(xì)胞凋亡以及增強(qiáng)心肌細(xì)胞自噬,改善DCM的心室重構(gòu);3.早期代謝調(diào)節(jié)通過(guò)激活PI3K/AKT改善胰島素抵抗,選擇性的激活MAPKs減輕心肌間質(zhì)纖維化以及通過(guò)AMPK/Beclin1-Bcl2信號(hào)通路抑制心肌細(xì)胞凋亡并且促進(jìn)自噬。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R587.2;R542.2

【參考文獻(xiàn)】

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1 蔡建生;彭志堅(jiān);;曲美他嗪對(duì)冠心病患者胰島素抵抗的臨床觀察[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2006年02期

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本文編號(hào)：1540053