本文關(guān)鍵詞： 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞 外泌體 制備 凍干粉 巨噬細(xì)胞 脂多糖 細(xì)胞炎癥模型 外泌體 抑制 大腸埃希菌 輸卵管慢性炎癥 動物模型 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞 外泌體 輸卵管慢性炎性損傷 不孕 治療 修復(fù)　出處：《暨南大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景據(jù)WHO統(tǒng)計,全球育齡的婦女不孕率達(dá)10%-15%[1],盆腔因素引起的不孕約占35%,其中慢性輸卵管炎引起輸卵管解剖和功能的破壞導(dǎo)致的不孕是臨床常見的原因。傳統(tǒng)藥物和手術(shù)治療可能對輕癥或早期輸卵管炎癥損傷有一定療效,但很大一部分患者最后依靠輔助生殖技術(shù)(assisted reproductive techniques,ART)。隨著試管嬰兒出生率的增加,ART面臨其所伴隨的并發(fā)癥、新生兒出生缺陷風(fēng)險以及不良圍產(chǎn)期結(jié)局較自然狀態(tài)受孕高的風(fēng)險和挑戰(zhàn)。因此,我們有必要繼續(xù)探索新的修復(fù)輸卵管炎性損傷,恢復(fù)其生殖功能的方法,力求配子(精子/卵子)在自然狀態(tài)下結(jié)合并生長發(fā)育。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)因其在更新和分化上的獨(dú)特魅力,日漸成為干細(xì)胞治療的掌上明珠,其中人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymalstem cells,hUC-MSCs)被進(jìn)一步證實(shí)更具臨床優(yōu)勢,獨(dú)特的低免疫原性,含量極其豐富,可以無創(chuàng)獲取。hUC-MSCs移植治療研究發(fā)現(xiàn)其獨(dú)特的抗炎及抗纖維化作用能促進(jìn)組織修復(fù)和再生,可作為細(xì)胞移植治療的首選。但hUC-MSCs因自身作用的局限性,比如潛在的致瘤性等,限制了其在臨床上的廣泛性應(yīng)用。近年來深層次研究MSCs的作用機(jī)理時發(fā)現(xiàn)MSCs“旁分泌”機(jī)制在疾病的治療中發(fā)揮著重要的作用,因此MSCs分泌因子日益成為研究的焦點(diǎn)。外泌體(exosomes)是體內(nèi)活細(xì)胞分泌的一種膜性小囊泡,是亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)復(fù)合體,可介導(dǎo)細(xì)胞相互間信息的傳遞。外泌體比細(xì)胞分泌的其它囊泡生物學(xué)特性清晰明確,應(yīng)用優(yōu)勢明顯:化學(xué)性質(zhì)更穩(wěn)定、能高效修復(fù)受損組織、組織選擇性高、靶向性投遞、易于保存方便運(yùn)輸。研究發(fā)現(xiàn)MSCs分泌的外泌體能發(fā)揮MSCs的部分生物學(xué)功能效應(yīng),被證實(shí)能治療臨床多種疾病。本研究將hUC-MSCs來源外泌體用于輸卵管慢性炎性損傷的SD大鼠模型的干預(yù)治療,從輸卵管結(jié)構(gòu)、分泌功能、受孕率的變化評價人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體(human umbilical cord mesenchymalstem cells exosomes,hUC-MSCs-Ex)的生物學(xué)效應(yīng),為輸卵管炎性不孕的治療探索新的具有廣泛臨床應(yīng)用前景的途徑。第一章hUC-MSCs來源外泌體的制備及鑒定目的:探索優(yōu)化的hUC-MSCs-Ex的制備方法,并制成方便應(yīng)用的凍干粉。方法:本實(shí)驗(yàn)通過組織塊直接貼壁法進(jìn)行分離,培養(yǎng)得到hUC-MSCs,同時對其獲得的細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定、細(xì)胞表面特異性標(biāo)志物與細(xì)胞多向分化能力的綜合鑒定。改良的差速離心法制備hUC-MSCs-Ex,透射電鏡鑒定其形態(tài),Bradford蛋白定量法定量檢測,SDS-PAGE凝膠電泳初步分析蛋白分子量及大小,Western Blot鑒定標(biāo)志蛋白CD63、CD81;通過凍干法將hUC-MSCs來源外泌體制成凍干粉保存。結(jié)果:本實(shí)驗(yàn)通過組織塊直接貼壁法進(jìn)行分離,培養(yǎng)得到hUC-MSCs;經(jīng)改良過的差速離心法制備的hUC-MSCs-Ex,透射電鏡下觀察形態(tài)結(jié)構(gòu),呈圓形或橢圓形囊泡狀結(jié)構(gòu),直徑在30-100nm,胞膜完整,胞內(nèi)為低電子密度成分;表達(dá)標(biāo)志性蛋白CD63、CD81;成功獲得hUC-MSCs-Ex凍干粉。結(jié)論:經(jīng)過改良的差速離心法制備的hUC-MSCs來源的外泌體的純度較高,可冷凍干燥成凍干粉,為后續(xù)的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)提供了相對更加穩(wěn)定可靠的移植源。第二章hUC-MSCs來源外泌體體外炎癥實(shí)驗(yàn)?zāi)康?通過體外巨噬細(xì)胞RAW264.7構(gòu)造細(xì)胞炎癥模型,檢測hUC-MSCs-Ex體外對炎癥的作用。方法:LPS刺激巨噬細(xì)胞RAW264.7構(gòu)造體外細(xì)胞炎癥模型,實(shí)驗(yàn)分5組,(1)空白對照組(NC):不添加任何藥物處理;(2)LPS模型組(LPS):0.1μg/ml LPS刺激;(3)exosomes低濃度組(Ex-L):0.1μg/ml LPS刺激后添加15μg/ml的exosomes;(4)exosomes中濃度組(Ex-M):0.1μg/ml LPS刺激后添加45μg/ml的exosomes;(5)exosomes高濃度組(Ex-H):0.1μg/ml LPS刺激后添加135μg/ml的exosomes。Western blot檢測各組炎癥因子腫瘤壞死因子-α的表達(dá)情況。結(jié)果:hUC-MSCs-Ex能夠下調(diào)炎癥因子腫瘤壞死因子-α的表達(dá),對LPS誘導(dǎo)的體外炎癥反應(yīng)具有抑制效果,且隨著外泌體作用濃度的增加,抑制作用越明顯,呈劑量依賴性抑制。結(jié)論:hUC-MSCs-Ex能有效抑制LPS誘導(dǎo)的體外炎癥反應(yīng)。第三章SD雌性大鼠慢性輸卵管炎癥模型的建立目的:用3×10~8/ml大腸埃希菌(單一菌)懸液注入SD雌性大鼠雙側(cè)輸卵管建立輸卵管慢性炎癥動物模型。方法:制備3×10~8/ml大腸埃希菌(單一菌)懸液,40只SD雌性大鼠隨機(jī)分兩組,其中正常組10只、大腸埃希菌液實(shí)驗(yàn)組40只。手術(shù)打開腹腔將大腸埃希菌懸液注入SD雌性大鼠雙側(cè)輸卵管。于手術(shù)后的第5天、10天、15天和20天分別取材,觀察輸卵管炎癥形成情況。結(jié)果:大腸埃希菌液實(shí)驗(yàn)組大鼠于手術(shù)后第15天表現(xiàn)為輸卵管慢性炎癥改變。結(jié)論:大腸埃希菌(單一菌)可以使SD雌性大鼠輸卵管發(fā)生炎癥反應(yīng),能成功建立輸卵管慢性炎癥模型。第四章hUC-MSCs來源外泌體對慢性輸卵管炎性損傷大鼠干預(yù)和評估目的:通過腹腔注射hUC-MSCs-Ex治療慢性輸卵管炎癥SD雌性大鼠動物模型,綜合評估hUC-MSCs-Ex對慢性輸卵管炎性不孕大鼠的治療效果。比較正常組和治療組心、肝、腎重要臟器的的結(jié)構(gòu)和功能的變化,了解本實(shí)驗(yàn)治療劑量下hUC-MSCs-Ex對SD大鼠的安全性。方法:3×10~8/ml大腸埃希菌(單一菌)懸液注入SD雌性大鼠雙側(cè)輸卵管建立輸卵管慢性炎癥動物模型,實(shí)驗(yàn)分為4組(每組n=20):(1)Sham組(假手術(shù)組),不予藥物處理;(2)M組(模型對照組),建模第15天開始腹腔注射0.9%氯化鈉注射液,0.5ml/只/天,共2周;(3)Ex-A組(建模同時給藥組),建模第2天開始用hUC-MSCs-Ex凍干粉以0.9%氯化鈉注射液稀釋,濃度為120μg/ml,劑量為0.5ml/只/天,腹腔注射共2周;(4)Ex-B組(建模后給藥組),建模第15天開始用0.9%氯化鈉注射液稀釋hUC-MSCs-Ex凍干粉,濃度為120μg/ml,劑量為0.5ml/只/天,腹腔注射共2周。治療2周后每組各處死一半大鼠(即每組10只)取血及輸卵管、心、肝、腎標(biāo)本。Elisa檢測各組大鼠血清中腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ濃度,光鏡和電鏡下觀察輸卵管結(jié)構(gòu)改變,Westernblot和實(shí)時熒光定量PCR檢測輸卵管組織中DPF-1及其mRNA的變化,Masson染色觀察輸卵管纖維化情況;各組剩余10只大鼠分別與雄性大鼠比較妊娠率和產(chǎn)仔數(shù)。同時比較各組大鼠之間的生化指標(biāo),光鏡下觀察各組大鼠心臟、肝臟、腎臟的結(jié)構(gòu)。結(jié)果:Ex-A組和Ex-B組大鼠在移植hUC-MSCs-Ex后,輸卵管的結(jié)構(gòu)恢復(fù)。Ex-A組和Ex-B組的輸卵管膠原纖維增生較M組均顯著減少(P0.05);Ex-A組和Ex-B組的DPF-1及其mRNA量較M組均有不同程度的升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。Ex-A組的腫瘤壞死因子-ɑ濃度較M組明顯降低(P0.05);Ex-B組大鼠血清中的腫瘤壞死因子-ɑ濃度較M組有所降低,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。Ex-A組大鼠血清中干擾素-γ濃度較M組明顯下降,具有顯著性差異(P0.05),Ex-B組血清中干擾素-γ濃度較M組有所下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。Ex-A組與Ex-B組相比,干擾素-γ濃度略低,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。Ex-A同籠組和Ex-B同籠組的妊娠率均為100%,Ex-A組平均產(chǎn)仔數(shù)比M組產(chǎn)仔數(shù)明顯增高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);與Sham組比較產(chǎn)仔數(shù)多且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。Ex-B組受孕率為100%,平均產(chǎn)仔數(shù)與M組相比,Ex-B組產(chǎn)仔數(shù)增多,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),與Sham組比較產(chǎn)仔數(shù)減少,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。Ex-A組比Ex-B組產(chǎn)仔數(shù)稍增多,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。各組大鼠的生化指標(biāo)均在正常范圍內(nèi),各組大鼠的心臟、肝臟、腎臟結(jié)構(gòu)正常。結(jié)論:hUC-MSCs-Ex一定程度上能恢復(fù)慢性輸卵管炎SD雌性大鼠的生殖能力。本實(shí)驗(yàn)治療劑量hUC-MSCs-Ex未發(fā)現(xiàn)改變SD大鼠心臟、肝臟、腎臟的結(jié)構(gòu)和功能,是安全的。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R711.6

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1528364