本文關鍵詞： 人臍帶間充質干細胞 外泌體 制備 凍干粉 巨噬細胞 脂多糖 細胞炎癥模型 外泌體 抑制 大腸埃希菌 輸卵管慢性炎癥 動物模型 人臍帶間充質干細胞 外泌體 輸卵管慢性炎性損傷 不孕 治療 修復　出處：《暨南大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：背景據(jù)WHO統(tǒng)計,全球育齡的婦女不孕率達10%-15%[1],盆腔因素引起的不孕約占35%,其中慢性輸卵管炎引起輸卵管解剖和功能的破壞導致的不孕是臨床常見的原因。傳統(tǒng)藥物和手術治療可能對輕癥或早期輸卵管炎癥損傷有一定療效,但很大一部分患者最后依靠輔助生殖技術(assisted reproductive techniques,ART)。隨著試管嬰兒出生率的增加,ART面臨其所伴隨的并發(fā)癥、新生兒出生缺陷風險以及不良圍產期結局較自然狀態(tài)受孕高的風險和挑戰(zhàn)。因此,我們有必要繼續(xù)探索新的修復輸卵管炎性損傷,恢復其生殖功能的方法,力求配子(精子/卵子)在自然狀態(tài)下結合并生長發(fā)育。間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)因其在更新和分化上的獨特魅力,日漸成為干細胞治療的掌上明珠,其中人臍帶來源的間充質干細胞(human umbilical cord mesenchymalstem cells,hUC-MSCs)被進一步證實更具臨床優(yōu)勢,獨特的低免疫原性,含量極其豐富,可以無創(chuàng)獲取。hUC-MSCs移植治療研究發(fā)現(xiàn)其獨特的抗炎及抗纖維化作用能促進組織修復和再生,可作為細胞移植治療的首選。但hUC-MSCs因自身作用的局限性,比如潛在的致瘤性等,限制了其在臨床上的廣泛性應用。近年來深層次研究MSCs的作用機理時發(fā)現(xiàn)MSCs“旁分泌”機制在疾病的治療中發(fā)揮著重要的作用,因此MSCs分泌因子日益成為研究的焦點。外泌體(exosomes)是體內活細胞分泌的一種膜性小囊泡,是亞細胞結構復合體,可介導細胞相互間信息的傳遞。外泌體比細胞分泌的其它囊泡生物學特性清晰明確,應用優(yōu)勢明顯:化學性質更穩(wěn)定、能高效修復受損組織、組織選擇性高、靶向性投遞、易于保存方便運輸。研究發(fā)現(xiàn)MSCs分泌的外泌體能發(fā)揮MSCs的部分生物學功能效應,被證實能治療臨床多種疾病。本研究將hUC-MSCs來源外泌體用于輸卵管慢性炎性損傷的SD大鼠模型的干預治療,從輸卵管結構、分泌功能、受孕率的變化評價人臍帶間充質干細胞來源外泌體(human umbilical cord mesenchymalstem cells exosomes,hUC-MSCs-Ex)的生物學效應,為輸卵管炎性不孕的治療探索新的具有廣泛臨床應用前景的途徑。第一章hUC-MSCs來源外泌體的制備及鑒定目的:探索優(yōu)化的hUC-MSCs-Ex的制備方法,并制成方便應用的凍干粉。方法:本實驗通過組織塊直接貼壁法進行分離,培養(yǎng)得到hUC-MSCs,同時對其獲得的細胞進行形態(tài)學鑒定、細胞表面特異性標志物與細胞多向分化能力的綜合鑒定。改良的差速離心法制備hUC-MSCs-Ex,透射電鏡鑒定其形態(tài),Bradford蛋白定量法定量檢測,SDS-PAGE凝膠電泳初步分析蛋白分子量及大小,Western Blot鑒定標志蛋白CD63、CD81;通過凍干法將hUC-MSCs來源外泌體制成凍干粉保存。結果:本實驗通過組織塊直接貼壁法進行分離,培養(yǎng)得到hUC-MSCs;經(jīng)改良過的差速離心法制備的hUC-MSCs-Ex,透射電鏡下觀察形態(tài)結構,呈圓形或橢圓形囊泡狀結構,直徑在30-100nm,胞膜完整,胞內為低電子密度成分;表達標志性蛋白CD63、CD81;成功獲得hUC-MSCs-Ex凍干粉。結論:經(jīng)過改良的差速離心法制備的hUC-MSCs來源的外泌體的純度較高,可冷凍干燥成凍干粉,為后續(xù)的體內外實驗提供了相對更加穩(wěn)定可靠的移植源。第二章hUC-MSCs來源外泌體體外炎癥實驗目的:通過體外巨噬細胞RAW264.7構造細胞炎癥模型,檢測hUC-MSCs-Ex體外對炎癥的作用。方法:LPS刺激巨噬細胞RAW264.7構造體外細胞炎癥模型,實驗分5組,(1)空白對照組(NC):不添加任何藥物處理;(2)LPS模型組(LPS):0.1μg/ml LPS刺激;(3)exosomes低濃度組(Ex-L):0.1μg/ml LPS刺激后添加15μg/ml的exosomes;(4)exosomes中濃度組(Ex-M):0.1μg/ml LPS刺激后添加45μg/ml的exosomes;(5)exosomes高濃度組(Ex-H):0.1μg/ml LPS刺激后添加135μg/ml的exosomes。Western blot檢測各組炎癥因子腫瘤壞死因子-α的表達情況。結果:hUC-MSCs-Ex能夠下調炎癥因子腫瘤壞死因子-α的表達,對LPS誘導的體外炎癥反應具有抑制效果,且隨著外泌體作用濃度的增加,抑制作用越明顯,呈劑量依賴性抑制。結論:hUC-MSCs-Ex能有效抑制LPS誘導的體外炎癥反應。第三章SD雌性大鼠慢性輸卵管炎癥模型的建立目的:用3×10~8/ml大腸埃希菌(單一菌)懸液注入SD雌性大鼠雙側輸卵管建立輸卵管慢性炎癥動物模型。方法:制備3×10~8/ml大腸埃希菌(單一菌)懸液,40只SD雌性大鼠隨機分兩組,其中正常組10只、大腸埃希菌液實驗組40只。手術打開腹腔將大腸埃希菌懸液注入SD雌性大鼠雙側輸卵管。于手術后的第5天、10天、15天和20天分別取材,觀察輸卵管炎癥形成情況。結果:大腸埃希菌液實驗組大鼠于手術后第15天表現(xiàn)為輸卵管慢性炎癥改變。結論:大腸埃希菌(單一菌)可以使SD雌性大鼠輸卵管發(fā)生炎癥反應,能成功建立輸卵管慢性炎癥模型。第四章hUC-MSCs來源外泌體對慢性輸卵管炎性損傷大鼠干預和評估目的:通過腹腔注射hUC-MSCs-Ex治療慢性輸卵管炎癥SD雌性大鼠動物模型,綜合評估hUC-MSCs-Ex對慢性輸卵管炎性不孕大鼠的治療效果。比較正常組和治療組心、肝、腎重要臟器的的結構和功能的變化,了解本實驗治療劑量下hUC-MSCs-Ex對SD大鼠的安全性。方法:3×10~8/ml大腸埃希菌(單一菌)懸液注入SD雌性大鼠雙側輸卵管建立輸卵管慢性炎癥動物模型,實驗分為4組(每組n=20):(1)Sham組(假手術組),不予藥物處理;(2)M組(模型對照組),建模第15天開始腹腔注射0.9%氯化鈉注射液,0.5ml/只/天,共2周;(3)Ex-A組(建模同時給藥組),建模第2天開始用hUC-MSCs-Ex凍干粉以0.9%氯化鈉注射液稀釋,濃度為120μg/ml,劑量為0.5ml/只/天,腹腔注射共2周;(4)Ex-B組(建模后給藥組),建模第15天開始用0.9%氯化鈉注射液稀釋hUC-MSCs-Ex凍干粉,濃度為120μg/ml,劑量為0.5ml/只/天,腹腔注射共2周。治療2周后每組各處死一半大鼠(即每組10只)取血及輸卵管、心、肝、腎標本。Elisa檢測各組大鼠血清中腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ濃度,光鏡和電鏡下觀察輸卵管結構改變,Westernblot和實時熒光定量PCR檢測輸卵管組織中DPF-1及其mRNA的變化,Masson染色觀察輸卵管纖維化情況;各組剩余10只大鼠分別與雄性大鼠比較妊娠率和產仔數(shù)。同時比較各組大鼠之間的生化指標,光鏡下觀察各組大鼠心臟、肝臟、腎臟的結構。結果:Ex-A組和Ex-B組大鼠在移植hUC-MSCs-Ex后,輸卵管的結構恢復。Ex-A組和Ex-B組的輸卵管膠原纖維增生較M組均顯著減少(P0.05);Ex-A組和Ex-B組的DPF-1及其mRNA量較M組均有不同程度的升高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。Ex-A組的腫瘤壞死因子-ɑ濃度較M組明顯降低(P0.05);Ex-B組大鼠血清中的腫瘤壞死因子-ɑ濃度較M組有所降低,但差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。Ex-A組大鼠血清中干擾素-γ濃度較M組明顯下降,具有顯著性差異(P0.05),Ex-B組血清中干擾素-γ濃度較M組有所下降,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。Ex-A組與Ex-B組相比,干擾素-γ濃度略低,但差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。Ex-A同籠組和Ex-B同籠組的妊娠率均為100%,Ex-A組平均產仔數(shù)比M組產仔數(shù)明顯增高,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05);與Sham組比較產仔數(shù)多且差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。Ex-B組受孕率為100%,平均產仔數(shù)與M組相比,Ex-B組產仔數(shù)增多,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05),與Sham組比較產仔數(shù)減少,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。Ex-A組比Ex-B組產仔數(shù)稍增多,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。各組大鼠的生化指標均在正常范圍內,各組大鼠的心臟、肝臟、腎臟結構正常。結論:hUC-MSCs-Ex一定程度上能恢復慢性輸卵管炎SD雌性大鼠的生殖能力。本實驗治療劑量hUC-MSCs-Ex未發(fā)現(xiàn)改變SD大鼠心臟、肝臟、腎臟的結構和功能,是安全的。
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【學位授予單位】：暨南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R711.6

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