本文關(guān)鍵詞： P311 表皮干細胞 肌成纖維樣細胞 肌成纖維細胞 轉(zhuǎn)分化 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)化生長因子β1　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景:燒傷、創(chuàng)傷、手術(shù)、糖尿病等引起的皮膚創(chuàng)面是常見的臨床問題之一。如何有效促進創(chuàng)面愈合、避免瘢痕形成是治療皮膚創(chuàng)面的關(guān)鍵。但由于對創(chuàng)面愈合和瘢痕形成的機制不甚清楚,導(dǎo)致創(chuàng)面和瘢痕的治療效果十分有限。目前認(rèn)為,肌成纖維細胞在創(chuàng)面愈合和瘢痕形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用:肌成纖維細胞產(chǎn)生的強大收縮力可以促進創(chuàng)面的快速閉合,但是如果肌成纖維細胞活性持續(xù)升高,則會導(dǎo)致瘢痕形成。皮膚創(chuàng)面愈合過程中,局部的成纖維細胞、骨髓和外周血中的纖維細胞、血管周細胞、血管平滑肌細胞等是經(jīng)典的肌成纖維細胞主要來源。表皮細胞主要通過分泌TGFβ1、b FGF、IL 1β、TNFα等因子來調(diào)控成纖維細胞向肌成纖維細胞的分化。我們推測,表皮干細胞(Epidermal stem cells,Ep SCs)可能具有轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細胞或肌成纖維樣細胞(Myofibroblast-like cells,MFLCs)的潛能,主要依據(jù)包括:(1)創(chuàng)面再上皮化過程中存在著上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)的行為特點。創(chuàng)面再上皮化時,創(chuàng)緣的Ep SCs逐漸失去緊密連接和頂?shù)讟O性,溶解基底膜,發(fā)生細胞骨架重排,獲得間質(zhì)細胞的特性,從而具備較強的遷移能力。(2)角質(zhì)形成細胞具有轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細胞的潛能,而Ep SCs可以分化為角質(zhì)形成細胞,并且是創(chuàng)面再上皮化的主要功能細胞。在TGFβ1、TNFα、IL 1β和FBS刺激下,表皮中的角質(zhì)形成細胞可以直接轉(zhuǎn)分化為成纖維細胞或肌成纖維細胞。人角質(zhì)形成細胞具有向脂肪細胞、平滑肌細胞和神經(jīng)細胞分化的潛能,甚至在連續(xù)傳代過程中就可有能發(fā)生EMT。(3)研究表明,創(chuàng)緣的表皮細胞可能是早期創(chuàng)面收縮力的主要來源,其收縮作用甚至早于創(chuàng)緣和肉芽組織中的肌成纖維細胞。(4)創(chuàng)面局部缺氧環(huán)境和大量的細胞因子(如TGFβ1、IL1β、TNFα)也可以誘導(dǎo)EMT。P311,又稱為神經(jīng)元再生相關(guān)蛋白(Neuronal regeneration related protein,NREP)、戊四唑17(Pentylenetetrazol 17,PTZ17)、神經(jīng)元蛋白3.1(Neuronal protein 3.1)等,是一種約8k Da的功能未知的胞漿蛋白,因為含有三個PEST結(jié)構(gòu)域和多個賴氨酸殘基,極易被泛素蛋白酶和基質(zhì)金屬蛋白酶降解,P311蛋白在細胞內(nèi)的半衰期僅約5分鐘。目前研究表明,P311參與了神經(jīng)再生、肺泡發(fā)育、腫瘤細胞侵襲、血壓穩(wěn)態(tài)維持、創(chuàng)面愈合和瘢痕形成。本課題組和他人結(jié)果表明,P311高表達于皮膚創(chuàng)面新生表皮的Ep SCs、肉芽組織的肌成纖維細胞和增生性瘢痕中,并且P311敲除小鼠的皮膚缺損創(chuàng)面愈合速度減慢。P311還可以促進成纖維細胞向肌成纖維細胞分化和Ep SCs遷移。因此,P311在肌成纖維細胞生成和Ep SCs調(diào)控中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn),P311是TGFβ1/Smad信號通路的重要調(diào)控因子:P311可以通過調(diào)控TGFβ1的自我誘導(dǎo)、TGFβ1的翻譯等調(diào)控TGFβ1表達,進而調(diào)控下游Smad信號通路。而TGFβ1/Smad信號通路是創(chuàng)面愈合和EMT的關(guān)鍵調(diào)控機制之一。因此,我們提出如下科學(xué)假說:P311通過TGFβ1/Smad信號通路調(diào)控創(chuàng)面愈合過程中表皮干細胞向肌成纖維樣細胞轉(zhuǎn)分化(Epidermal stem cell to myofibroblast-like cell transdifferentiation,Ep My T)。本研究主要分為以下三個方面:P311在Ep My T中的具體作用,P311通過TGFβ1/Smad信號通路調(diào)控Ep My T,P311調(diào)控TGFβ1的可能分子機制。方法:1.P311在表皮干細胞向肌成纖維樣細胞轉(zhuǎn)分化中的作用。1.1 P311在體外小鼠和人原代表皮干細胞向肌成纖維樣細胞轉(zhuǎn)分化中的作用。利用兩步消化法、IV型膠原差速貼壁法和KSFM無血清培養(yǎng)基,從人包皮和新生小鼠中分離培養(yǎng)原代Ep SCs,并利用流式細胞術(shù)進行鑒定。利用腺病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)使Ep SCs高表達P311,利用流式細胞術(shù)和實時定量PCR檢測轉(zhuǎn)染效率。利用免疫熒光染色、實時定量PCR和Western blot檢測P311高表達后Ep SCs中表皮干細胞標(biāo)志E-cadherin和β1 integrin、肌成纖維細胞標(biāo)志Vimentin和α-SMA的表達水平,利用Western blot檢測I型膠原和MMP2表達,利用凝膠收縮實驗觀察Ep SCs收縮能力,利用劃痕實驗觀察Ep SCs遷移能力。1.2 P311在體內(nèi)小鼠和人燒傷創(chuàng)面Ep My T中的作用。利用恒溫燙傷儀制作小鼠背部淺II°燙傷模型,大體和HE染色觀察P311敲除小鼠和野生型小鼠的傷口愈合和再上皮化規(guī)律,免疫組化染色觀察表皮中Vimentin和α-SMA的表達情況,實時定量PCR和Western blot檢測創(chuàng)面Ep My T相關(guān)標(biāo)志物的表達水平。利用免疫組化染色和連續(xù)切片、免疫熒光染色復(fù)合免疫組化染色等技術(shù)觀察燒傷患者表皮中P311、Vimentin和α-SMA的表達以及共定位情況。1.3燒傷創(chuàng)面微環(huán)境對Ep SCs內(nèi)P311和α-SMA表達的影響。利用實時定量PCR檢測IL1β、TNFα、IL6和缺氧等創(chuàng)面微環(huán)境對Ep SCs內(nèi)P311和α-SMA m RNA表達的影響。2.P311通過TGFβ1/Smad信號通路調(diào)控Ep My T。2.1 P311對TGFβ1/Smad通路的調(diào)控作用。利用ELISA、實時定量PCR和Western blot檢測高表達或敲除P311對TGFβ1m RNA、TGFβ1蛋白合成和分泌的影響。利用Western blot檢測高表達或敲除P311對Smad 2和Smad 3蛋白表達和磷酸化的影響。2.2 TβRI/II抑制劑LY2109761、Smad3 si RNA和外源性TGFβ1對P311引起的Ep My T的調(diào)控作用。利用免疫熒光染色和Western blot檢測TβRI/II抑制劑LY2109761對P311引起的Ep My T的阻斷作用。利用Western blot檢測Smad3 si RNA對P311引起的Ep My T的阻斷作用。利用Western blot檢測外源性TGFβ1對P311敲除小鼠Ep SCs轉(zhuǎn)分化能力的恢復(fù)作用。3.P311調(diào)控TGFβ1表達的分子機制。3.1 P311調(diào)控TGFβ1表達的主要階段。利用TGFβ1啟動子報告基因載體、亞硫酸氫鹽測序法、放線菌素D刺激復(fù)合實時定量PCR法、TGFβ1非翻譯區(qū)(Untranslated region,UTR)報告基因載體等檢測P311對TGFβ1啟動子活性、啟動子甲基化、m RNA穩(wěn)定性和UTR活性的影響。3.2 P311調(diào)控TGFβ1 UTR活性的可能機制。Genebank下載所有物種P311和TGFβ1氨基酸和m RNA序列,利用DNAMAN軟件進行P311和TGFβ1多序列比對、同源性分析和進化樹繪制,利用DNASTAR分析TGFβ1各區(qū)段長度和GC含量,利用RPISeq和Lnc Pro預(yù)測人P311蛋白和人TGFβ15’-UTR和3’-UTR各調(diào)控區(qū)域的相互作用可能性,利用BINDN+、RNABINDRPLUS和SNBRFinder預(yù)測P311蛋白的可能RNA結(jié)合位點。3.3 P311可能通過e IF6間接調(diào)控TGFβ1的蛋白表達。利用Western blot檢測Ep SCs中高表達或敲除P311對e IF6表達的影響、敲降或沉默e IF6對TGFβ1蛋白表達的影響。結(jié)果:1.P311在體外小鼠和人原代表皮干細胞向肌成纖維樣細胞轉(zhuǎn)分化中的作用。1.1成功分離培養(yǎng)并轉(zhuǎn)染小鼠和人原代Ep SCs。培養(yǎng)的Ep SCs呈克隆樣生長,每個細胞呈立方形,并且95%以上的細胞為CD49f+CD71—Ep SCs。腺病毒轉(zhuǎn)染48小時后,95%以上Ep SCs表達GFP,P311 m RNA含量明顯升高。1.2 P311促進小鼠表皮干細胞向肌成纖維樣細胞,而不是肌成纖維細胞轉(zhuǎn)分化。P311腺病毒轉(zhuǎn)染72小時后,小鼠Ep SCs體積變大、呈長梭形和扁平狀,α-SMA和Vimentin陽性細胞比例升高、E-cadherin陽性細胞比例下降,細胞骨架由網(wǎng)狀皮質(zhì)排列重排為應(yīng)力絲結(jié)構(gòu),α-SMA蛋白和m RNA水平分別升高為空載體組的2.69倍(P0.05)和1.56倍(P0.01),Vimentin蛋白水平升高為空載體組的1.72倍(P0.05),E-cadherin和β1integrin蛋白水平分別降低為空載體組的32%和68%(P0.05)。P311組Ep SCs遷移指數(shù)升高到空載體組的6.29倍(P0.01),I型膠原和MMP2蛋白水平分別升高到空載體組的11.21倍和1.45倍(P0.05),但P311組和空載體組膠原凝膠均未出現(xiàn)明顯收縮。1.3 P311促進人表皮干細胞向肌成纖維樣細胞轉(zhuǎn)分化。P311高表達后,人Ep SCs內(nèi)α-SMA+細胞比例顯著升高(35%vs 3%,P0.01),E-cadherin陽性細胞比例顯著降低(22%vs 63%,P0.01)。同時,α-SMA蛋白水平升高為空載體組的2.09倍(P0.05),E-cadherin和β1integrin蛋白水平分別降低為空載體組的57.68%和32.87%(P0.05)。2.P311在人和小鼠燒傷創(chuàng)面Ep My T中的可能作用。2.1 P311敲除小鼠燒傷創(chuàng)面愈合和再上皮化速度減慢。大體觀察發(fā)現(xiàn),P311敲除小鼠傷口絕對面積和面積百分比在傷后2天、4~7天均顯著高于P311野生型小鼠。HE染色發(fā)現(xiàn),傷后4天和7天P311敲除小鼠傷口再上皮化速度顯著慢于P311野生型小鼠。傷后7天,P311敲除小鼠傷口的表皮間距顯著寬于P311野生型小鼠(9.87 mm vs 6.82 mm,P0.05),新生表皮長度顯著短于野生型小鼠(1.48 mm vs 2.14 mm,P0.05)。2.2 P311敲除小鼠燒傷創(chuàng)面中Ep My T水平可能下降。免疫組化染色發(fā)現(xiàn),P311敲除小鼠新生表皮中Vimentin+細胞數(shù)目低于P311野生型小鼠,而未觀察到表皮α-SMA的特異性表達。P311敲除小鼠創(chuàng)面內(nèi)Vimentin、TGFβ1、TWIST1和Snail2 m RNA水平均顯著低于P311野生型小鼠。并且,P311敲除小鼠創(chuàng)面內(nèi)β1 integrin蛋白水平顯著高于P311野生型小鼠。P311敲除小鼠正常皮膚和燒傷創(chuàng)面中Vimentin、LAP-TGFβ1和活性TGFβ1蛋白水平顯著低于P311野生型小鼠。2.3 P311在人燒傷創(chuàng)面Ep My T中的可能作用。燒傷創(chuàng)面表皮中α-SMA、Vimentin、P311陽性細胞均多于正常皮膚,共染發(fā)現(xiàn)人燒傷創(chuàng)面表皮中存在著P311+α-SMA+細胞和P311+Vimentin+細胞。3.燒傷創(chuàng)面微環(huán)境對Ep SCs內(nèi)P311和α-SMA m RNA表達的影響。IL1β和TNFα使Ep SCs內(nèi)P311 m RNA水平升高40倍以上(P0.01),缺氧使其升高7.58倍(P0.01),IL6使其升高4.05倍(P0.05)。并且,IL1β、TNFα、IL6和缺氧均引起Ep SCs內(nèi)α-SMA m RNA水平明顯升高(P0.05)。4.P311對TGFβ1/Smad通路的調(diào)控作用。4.1 P311對TGFβ1表達的調(diào)控作用。P311組Ep SCs內(nèi)LAP-TGFβ1和活性TGFβ1蛋白的水平分別升高到空載體組的4.21和6.89倍(P0.01),TGFβ1 m RNA水平下降至空載體組的78.81%(P0.01),TβRI和TβRII m RNA水平分別升高到空載體組的1.72倍(P0.05)和2.22倍(P0.01)。P311敲除小鼠Ep SCs的培養(yǎng)上清內(nèi)TGFβ1總蛋白水平降至P311野生型小鼠Ep SCs的51.15%(P0.05)。4.2 P311促進Smad2和Smad3蛋白的磷酸化。P311組Ep SCs內(nèi)p Smad2和p Smad3比例分別升高為空載體組的2.51倍和2.80倍(P0.01)。外源性TGFβ1刺激下,P311敲除小鼠Ep SCs內(nèi)p Smad2和p Smad3比例分別降至P311野生型小鼠Ep SCs的52.17%和65.71%(P0.05)。但敲除或高表達P311對Smad2和Smad3總蛋白水平無顯著影響。5.TβRI/II抑制劑LY2109761阻斷P311引起的Ep My T。LY2109761可以顯著抑制P311引起的p Smad2和p Smad3表達升高。LY2109761可以使P311高表達Ep SCs失去肌成纖維細胞樣形態(tài)。并且,LY2109761將P311組α-SMA+細胞比例從39.99%降至7.93%,將E-cadherin+細胞比例從8.37%升至43.43%(P0.01)。同時,LY2109761可顯著抑制P311組Ep SCs內(nèi)升高的α-SMA和Vimentin蛋白水平,提高P311組Ep SCs內(nèi)降低的β1integrin和E-cadherin蛋白水平(P0.01)。此外,LY2109761可顯著降低P311組Ep SCs內(nèi)I型膠原和MMP2蛋白水平。6.Smad3 si RNA阻斷P311引起的Ep My T。Smad3 si RNA可使Smad3蛋白水平降低為P311組的40.64%(P0.05),幾乎完全抑制p Smad3的表達(P0.01)。P311+Smad3 si RNA組Ep SCs內(nèi)α-SMA水平顯著低于P311組和P311+mock si RNA組(P0.01),E-cadherin水平顯著高于P311組和P311+mock si RNA組(P0.01),但與空載體組無顯著差異。7.外源性TGFβ1可以恢復(fù)P311敲除小鼠Ep My T的能力。TGFβ1刺激后,P311敲除小鼠和野生型小鼠Ep SCs內(nèi)α-SMA蛋白水平均顯著升高。并且,TGFβ1刺激后的P311敲除小鼠Ep SCs內(nèi)α-SMA蛋白水平與TGFβ1未刺激的P311野生型小鼠Ep SCs內(nèi)α-SMA蛋白水平無顯著差異。8.P311通過促進啟動子甲基化和提高UTR活性調(diào)控TGFβ1表達。P311對TGFβ1啟動子活性無顯著影響,但可以增加TGFβ1啟動子的甲基化位點。m RNA穩(wěn)定性結(jié)果發(fā)現(xiàn),P311組TGFβ1 m RNA的降解速率略低于空載體組(斜率:-0.0805 vs-0.112),但二者無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.4531)。并且,P311組TGFβ1 5’-UTR、3’-UTR’和3’/5’-UTR的活性均顯著高于空載體組。9.P311調(diào)控TGFβ1 UTR活性的可能機制。14個物種間TGFβ1的氨基酸和ORF區(qū)域相似率均在80%以上,而5’-UTR和3’-UTR區(qū)域的總相似率分別僅為30.45%和15.18%。人和小鼠TGFβ1 5’-UTR的長度分別為889bp和867bp,GC含量分別為71.6%和65.9%;3’-UTR長度分別為521 bp和134bp,GC含量分別為57.8%和76.9%。P311結(jié)合于TGFβ1 5’-UTR中63~121和422~615的抑制區(qū)域、77~106的莖環(huán)區(qū)域和3’-UTR的可能性大于50%。進一步分析發(fā)現(xiàn),29R、31P、33P、34K、35E、36V、37N、38R、39K可能是P311結(jié)合于RNA的主要位點。10.P311可能通過e IF6間接調(diào)控TGFβ1蛋白表達。P311高表達引起Ep SCs內(nèi)e IF6蛋白表達下降,而P311敲除引起e IF6蛋白表達升高。e IF6敲降或沉默使Ep SCs內(nèi)活性TGFβ1和LAP-TGFβ1的水平明顯升高。結(jié)論:本研究首次證實,P311是一種新的表皮干細胞向肌成纖維樣細胞轉(zhuǎn)分化的調(diào)控因子,并且TGFβ1/Smad通路在其中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。P311通過增強TGFβ1啟動子甲基化抑制TGFβ1轉(zhuǎn)錄,通過結(jié)合并激活TGFβ1 5’-UTR和3’-UTR促進TGFβ1翻譯。燒傷創(chuàng)面局部的炎性因子和缺氧微環(huán)境可誘導(dǎo)表皮干細胞P311的表達。敲除P311可導(dǎo)致燒傷創(chuàng)面愈合延遲。因此,研究結(jié)果不僅可以表明表皮干細胞可能是皮膚創(chuàng)面愈合中肌成纖維細胞的另一重要來源,更為重要的是,發(fā)現(xiàn)了一種新的皮膚創(chuàng)面愈合機制,即:炎性因子和缺氧-P311-TGFβ1-Smad2/3-Ep My T-MMP2和I型膠原分泌增多-遷移能力增強-創(chuàng)面愈合加快。研究結(jié)果豐富和完善了P311的生物學(xué)功能和燒傷創(chuàng)面愈合機理,同時為創(chuàng)面愈合的基礎(chǔ)研究和臨床治療提供新靶點和新線索。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R64
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本文編號：1528000