本文關(guān)鍵詞： 二硫環(huán)化FITC-PI 小分子多肽 乳腺癌 肺癌 腫瘤靶向治療 跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo) 穿膜機(jī)制 分泌性載體膜蛋白4 泛素-C蛋白　出處：《昆明醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：[目的]本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)了一種具有僅對(duì)人三陰乳腺癌細(xì)胞(MDA-MB-231)和人肺癌細(xì)胞(Calu-1)這兩種細(xì)胞系具有特異親和性的11肽,將其進(jìn)行FITC熒光標(biāo)記后我們觀察到其能夠穿膜進(jìn)入MDA-MB-231和Calu-1細(xì)胞并在胞漿內(nèi)定位,后續(xù)實(shí)驗(yàn)提示,將此小肽兩端添加二硫鍵環(huán)化處理后其特異性穿膜效應(yīng)效果最佳(將此小肽命名為二硫環(huán)化FITC-PI),進(jìn)一步體內(nèi)外研究提示,二硫環(huán)化FITC-PI自身能夠靶向定位于靶細(xì)胞,并表現(xiàn)出良好的載體特性�；谇捌谘芯拷Y(jié)果,本課題論文主要探討二硫環(huán)化FITC-PI的靶向跨膜轉(zhuǎn)移機(jī)制,揭示并定位MDA-MB-231和Calu-1細(xì)胞膜蛋白中介導(dǎo)二硫環(huán)化FITC-PI跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的特異性轉(zhuǎn)導(dǎo)膜蛋白,分析此膜蛋白中與二硫環(huán)化FITC-PI跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能密切相關(guān)的膜蛋白功能結(jié)構(gòu)域,并進(jìn)一步探索與二硫環(huán)化FITC-PI在胞漿內(nèi)協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)直接相關(guān)的胞漿蛋白及胞漿定位表達(dá),為二硫環(huán)化FITC-PI應(yīng)用于腫瘤靶向治療及早期診斷方面提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。[方法]1.通過對(duì)人乳腺癌MDA-MB-231及人肺癌Calu-1細(xì)胞的各自20個(gè)STR位點(diǎn)及1個(gè)Amelogenin性別位點(diǎn)進(jìn)行STR位點(diǎn)檢測,與ATCC、DSMZ、JCRB和RIKEN的對(duì)應(yīng)細(xì)胞系進(jìn)行比對(duì),觀察本實(shí)驗(yàn)室保存用于本實(shí)驗(yàn)的MDA-MB-231及Calu-1細(xì)胞無交叉污染后,人工合成標(biāo)記FITC綠色熒光的二硫鍵環(huán)化FITC-PI。2.利用四種細(xì)胞膜非特異性通道抑制劑(包括氯丙嗪、制霉菌素、鹽酸阿米洛利以及磷酸氯喹)分別阻斷靶細(xì)胞膜上的巨胞飲、網(wǎng)格蛋白依賴途徑、胞膜窖介導(dǎo)途徑以及內(nèi)涵體成熟介導(dǎo)非特異性內(nèi)吞途徑,檢測阻斷前后二硫環(huán)化FITC-PI在細(xì)胞中的表達(dá),觀察二硫環(huán)化FITC-PI是否可通過細(xì)胞膜上的非特異性穿膜機(jī)制發(fā)揮其穿膜效應(yīng)。3.前期實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)二硫環(huán)化FITC-PI僅對(duì)MDA-MB-231和Calu-1細(xì)胞有特異性穿膜效應(yīng),因此,我們認(rèn)為MDA-MB-231和Calu-1細(xì)胞膜上可能具有相同或類似的可協(xié)助二硫環(huán)化FITC-PI特異性穿膜的膜蛋白,因此,我們選擇iTRAQ技術(shù)將MDA-MB-231及Calu-1細(xì)胞的全部胞膜蛋白進(jìn)行分析及鑒定,我們選擇人乳腺癌MCF-7細(xì)胞(前期實(shí)驗(yàn)中已證實(shí)二硫環(huán)化FITC-PI不能穿膜的細(xì)胞之一)全部膜蛋白數(shù)據(jù)作為對(duì)照,通過蛋白預(yù)測軟件,篩選出與二硫環(huán)化FITC-PI特異性穿膜進(jìn)入MDA-MB-231和Calu-1細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)關(guān)鍵膜蛋白為SCAMP4蛋白,采用COMPARTMENTS數(shù)據(jù)庫分析SCAMP4蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位情況。通過RT-PCR及Western-blot檢測SCAMP4蛋白是否存在于MDA-MB-231和Calu-1細(xì)胞并對(duì)其表達(dá)量進(jìn)行分析。4.在證實(shí)SCAMP4蛋白在MDA-MB-231和Calu-1細(xì)胞真實(shí)存在后,我們進(jìn)一步利用Label free法對(duì)于MDA-MB-231及Calu-1細(xì)胞的全部胞漿蛋白數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,隨后采用string軟件構(gòu)建SCAMP4蛋白協(xié)助二硫環(huán)化FITC-PI穿膜進(jìn)入細(xì)胞并在胞漿內(nèi)的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò),將此蛋白互做網(wǎng)絡(luò)中與SCAMP4蛋白發(fā)生作用的漿蛋白節(jié)點(diǎn)蛋白數(shù)據(jù)與MDA-MB-231及Calu-1中胞漿蛋白數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì),完整繪制二硫環(huán)化FITC-PI在細(xì)胞膜蛋白SCAMP4蛋白協(xié)同下轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞后在細(xì)胞漿內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)。[結(jié)果]1.經(jīng)過對(duì)MDA-MB-231以及Calu-1細(xì)胞的各自20個(gè)STR位點(diǎn)及1個(gè)Amelogenin性別位點(diǎn)進(jìn)行STR位點(diǎn)檢測,證實(shí)本實(shí)驗(yàn)所采用的MDA-MB-231及Calu-1細(xì)胞與ATCC、DSMZ、JCRB和RIKEN的對(duì)應(yīng)細(xì)胞系為同一遺傳背景來源的細(xì)胞,由此進(jìn)行的細(xì)胞后續(xù)實(shí)驗(yàn)無誤,具備可重復(fù)性。同時(shí),本實(shí)驗(yàn)成功合成了二硫環(huán)化FITC-PI并對(duì)其進(jìn)行鑒定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí),重新優(yōu)化并合成的二硫環(huán)化FITC-PI能夠特異性的穿膜進(jìn)入MDA-MB-231以及Calu-1細(xì)胞中。2.在非特異跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制研究中,我們發(fā)現(xiàn),二硫環(huán)化FITC-PI可通過直接轉(zhuǎn)運(yùn)方式穿膜進(jìn)入MDA-MB-231以及Calu-1細(xì)胞。二硫環(huán)化FITC-PI可通過胞膜窖介導(dǎo)、巨胞飲介導(dǎo)以及干擾內(nèi)涵體成熟的細(xì)胞內(nèi)吞方式穿膜進(jìn)入MDA-MB-231細(xì)胞,二硫環(huán)化FITC-PI可通過胞膜窖介導(dǎo)、巨胞飲介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞方式進(jìn)入Calu-1細(xì)胞。3.分別提取MDA-MB-231、Calu-1及MCF-7細(xì)胞膜蛋白,通過iTRAQ技術(shù)將上述三株細(xì)胞的膜蛋白進(jìn)行對(duì)比分析,研究結(jié)果發(fā)現(xiàn):MDA-MB-231及Calu-1細(xì)胞(相對(duì)于MCF-7細(xì)胞)高表達(dá)或特有的(P0.05)膜上轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包括 B3KVN0,Q9ULF5,Q14332,B4DTS6,095864,P48509,SCAMP4,F8WDZ3,Q14114,B3KQX7。在 MDA-MB-231 及 Calu-1 細(xì)胞中都檢測到但在MCF-7系中沒有檢測到的膜蛋白有HOY544,B7Z1M0,AOAOS2Z5F9,C9KOC8。利用Uniport蛋白數(shù)據(jù)庫對(duì)上述膜蛋白的功能進(jìn)行預(yù)測分析,我們發(fā)現(xiàn),僅有SCAMP4是與蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)特別是小肽跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)密切相關(guān)的,提示:在MDA-MB-231及Calu-1細(xì)胞系中高表達(dá)而相對(duì)于MCF-7細(xì)胞中低表達(dá)的轉(zhuǎn)運(yùn)膜蛋白SCAMP4是與二硫環(huán)化FITC-PI特異性穿膜密切相關(guān)的。隨后利用 COMPARTMENTS(Subcellular localization database)數(shù)據(jù)庫針對(duì)SCAMP4的細(xì)胞膜定位分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)SCAMP4蛋白在細(xì)胞質(zhì)膜上表達(dá),同時(shí),在高爾基體上也有較少表達(dá)。4.我們進(jìn)一步利用Label free法對(duì)于MDA-MB-231及Calu-1細(xì)胞的全部胞漿蛋白數(shù)據(jù)進(jìn)行分析及鑒定,隨后采用string軟件構(gòu)建SCAMP4蛋白穿膜進(jìn)入細(xì)胞并在胞漿內(nèi)的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò),將此蛋白互做網(wǎng)絡(luò)中與SCAMP4蛋白發(fā)生作用的漿蛋白節(jié)點(diǎn)蛋白數(shù)據(jù)與MDA-MB-231及Calu-1中胞漿蛋白數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì),我們發(fā)現(xiàn),能夠與SCAMP4蛋白直接作用的而且存在于MDA-MB-231及Calu-1細(xì)胞中的胞漿蛋白為polyubiquitin C蛋白。因此,polyubiquitin C蛋白應(yīng)該是SCAMP4蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)外源性物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞后并導(dǎo)入胞漿的一個(gè)協(xié)同蛋白。此后,我們將SCAMP4蛋白的4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域序列與二硫環(huán)化FITC-PI的蛋白序列進(jìn)行了同源性比對(duì)分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),二硫環(huán)化FITC-PI與SCAMP4第一個(gè)跨膜區(qū)域的蛋白序列有重疊,提示二硫環(huán)化FITC-PI可能是通過與SCAMP4第一個(gè)跨膜區(qū)域特異性結(jié)合后跨膜進(jìn)入細(xì)胞。[結(jié)論]1.本研究制備的二硫環(huán)化FITC-PI可通過直接轉(zhuǎn)運(yùn)方式穿膜進(jìn)入人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞及人肺癌Calu-1細(xì)胞:二硫環(huán)化FITC-PI可通過胞膜窖介導(dǎo)、巨胞飲介導(dǎo)以及干擾內(nèi)涵體成熟的細(xì)胞內(nèi)吞方式穿膜進(jìn)入人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞;二硫環(huán)化FITC-PI可通過胞膜窖介導(dǎo)、巨胞飲介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞方式穿膜人肺癌Calu-1細(xì)胞。2.本研究通過iTRAQ技術(shù)篩選得到與二硫環(huán)化FITC-PI特異性內(nèi)化進(jìn)入人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231、人肺癌細(xì)胞Calu-1細(xì)胞的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白SCAMP4。SCAMP4蛋白是在人乳腺癌細(xì)胞MDA-MJB-231、人肺癌細(xì)胞Calu-1細(xì)胞系中高表達(dá)而相對(duì)于人乳腺癌細(xì)胞MCF-7中低表達(dá)的。3.SCAMP4蛋白是協(xié)助二硫環(huán)化FITC-PI穿膜進(jìn)入MDA-MB-231及Calu-1的特異性膜蛋白,SCAMP4蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)膜上,SCAMP4蛋白的第一個(gè)跨膜區(qū)域與二硫環(huán)化FITC-PI穿膜有關(guān)。4.胞漿蛋白polyubiquitinC是胞膜蛋白SCAMP4在細(xì)胞內(nèi)蛋白互作體。二硫環(huán)化 FITC-PI 穿膜進(jìn)入 MDA-MB-231 與 Calu-1 細(xì)胞后,在 polyubiquitin C 協(xié)同下,二硫環(huán)化FITC-PI轉(zhuǎn)運(yùn)至胞漿中。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R737.9

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1504410