發(fā)布時間：2018-02-10 17:36

  本文關(guān)鍵詞： 食管鱗狀細(xì)胞癌 miRNAs基因表達(dá)譜芯片 miRNA-612 wt-P53 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移　出處：《山東大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：食管鱗狀細(xì)胞癌(Esophageal squamous cell carcinomas,ESCC)作為全球常見的惡性腫瘤之一,具有起病隱匿,高侵襲性生長以及手術(shù)治療后病死率、復(fù)發(fā)率高等臨床特征,大多數(shù)患者在臨床確診時已經(jīng)進(jìn)入中晚期階段。目前治療本病的主要方法是手術(shù)切除加術(shù)后放化療等,其手術(shù)切除率58%～92%。ESCC的高侵襲性和高轉(zhuǎn)移率是預(yù)后差的主要原因,不少患者經(jīng)手術(shù)切除后常發(fā)生轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā),其預(yù)后情況依賴于早期診斷。微小RNA(microRNA,miRNAs)是最近發(fā)現(xiàn)的一類非編碼RNA,在腫瘤的發(fā)生、侵襲及轉(zhuǎn)移等病理生理過程中扮演著非常重要的作用。miRNAs 一方面可作為癌基因下調(diào)抑癌基因的表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長,另一方面又可作為抑癌基因在轉(zhuǎn)錄后水平與原癌基因結(jié)合,抑制其表達(dá),從而抑制腫瘤的生長。近來研究表明,miRNAs異常表達(dá)即表達(dá)上調(diào)或下調(diào)可能與人類多種腫瘤的發(fā)生及轉(zhuǎn)移相關(guān),因此作為目前最受關(guān)注的生物分子之一,成為腫瘤病理學(xué)領(lǐng)域的研究熱點。近來在腫瘤研究的領(lǐng)域中備受關(guān)注的熱點問題主要包括miRNAs基因表達(dá)譜的篩選,靶基因預(yù)測及相互調(diào)控的功能研究等。在ESCC的發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移中,miRNAs所扮演的重要角色受到人們越來越多的關(guān)注,對于那些參與了 ESCC的發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移進(jìn)程的特異性的miRNAs,有可能會成為臨床工作中指導(dǎo)其早期診斷及判斷病程進(jìn)展、預(yù)后的臨床標(biāo)志物。然而在ESCC的進(jìn)展及轉(zhuǎn)移中,關(guān)于特異性miRNAs所發(fā)揮的作用仍處于探索階段。因此,本研究選用表達(dá)譜基因芯片技術(shù)對ESCC進(jìn)行表達(dá)譜研究,從中篩選出特異性的miRNAs。緊接著我們選擇細(xì)胞株及追加大樣本組織對其進(jìn)行功能及調(diào)控機(jī)制方面的相關(guān)研究。利用生物信息學(xué)分析,篩選出miRNAs可能的靶基因,并在基因水平上驗證靶基因與miRNAs的關(guān)系,從而揭示miRNAs通過調(diào)節(jié)其靶基因促進(jìn)ESCC的浸潤和轉(zhuǎn)移。研究目的1、應(yīng)用miRNAs表達(dá)譜基因芯片技術(shù),探討ESCC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組差異性表達(dá)的miRNAs。2、篩選出一種特異性miRNA-612,采用RT-PCR方法檢測組織中特異性表達(dá)的miRNA-612,從而驗證與基因芯片結(jié)果的一致性。3、利用生物信息學(xué)分析,篩選出miRNA-612特異性靶基因wt-P53。4、選取ESCC細(xì)胞株,通過細(xì)胞劃痕實驗、Transwell小室細(xì)胞遷移實驗及侵襲實驗進(jìn)行miRNA-612的功能驗證。5、Egfp熒光素酶報告載體實驗驗證wt-P53為miRNA-612的特異性靶基因。6、檢測wt-P53在正常粘膜組織及ESCC組織中存在差異表達(dá)。7、從基因和蛋白水平分別驗證miRNA-612和wt-P53在ESCC中存在的靶向關(guān)系。材料和方法1、選取10例ESCC新鮮凍存組織及對應(yīng)的正常食管粘膜組織,采用上�？党缮镉邢薰敬淼腅xiqon公司的miRNAs表達(dá)譜芯片,Trizol法提取總RNA,采用AxonGenePix4000B芯片掃描儀獲取芯片的熒光強(qiáng)度,GenePix pro V6.0軟件獲取數(shù)據(jù)并進(jìn)行原始數(shù)據(jù)分析,t檢驗結(jié)合Fold Change篩選出差異表達(dá)的miRNAs。采用MEV software(v4.6,TIGR)對篩選出的miRNAs進(jìn)行聚類分析,篩選出和ESCC轉(zhuǎn)移相關(guān)的差異表達(dá)的基因。2、選擇基因表達(dá)譜芯片測定中明顯上調(diào)的特異性miRNA-612,以U6作為內(nèi)參基因進(jìn)行校正和標(biāo)準(zhǔn)化,使用RT-PCR方法予以驗證與基因芯片的一致性。3、分別統(tǒng)計 TargetScans、Pictar、miRanda 和 MirTarget2 四種生物信息數(shù)據(jù)庫,取四種數(shù)據(jù)庫所預(yù)測的交集作為靶基因,進(jìn)行基因本體論(Gene Ontology,GO)分析和基因功能分類,結(jié)合既往對ESCC癌基因的研究統(tǒng)計數(shù)據(jù)庫,篩選出miRNA-612可能的靶基因。4、以人ESCC EC109細(xì)胞株進(jìn)行miRNA-612沉默質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染。使用RT-PCR技術(shù)驗證各組的轉(zhuǎn)染效率。隨后對不同組別的細(xì)胞株進(jìn)行功能驗證,包括細(xì)胞劃痕實驗、Transwell小室細(xì)胞遷移實驗及細(xì)胞侵襲實驗。5、將表達(dá)miRNA-612的質(zhì)粒pSilencer/miR-612或者對照質(zhì)粒pSilencer/NC和熒光報告載體pcDNA3-Egfp-P53-3'UTR或者突變后的熒光報告載體質(zhì)粒 pcDNA3-Egfp-P53-3'UTRmut,采用 LipofeCtamine2000 共轉(zhuǎn)染 EC109細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后48 h,使用熒光分光光度儀分別檢測綠色熒光蛋白表達(dá)水平的變化。6、收集2002年4月～2005年2月期間山東大學(xué)附屬千佛山醫(yī)院胸外科ESCC根治手術(shù)病例,分別選取有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的新鮮凍存標(biāo)本34例和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的新鮮凍存標(biāo)本36例,正常鱗狀上皮粘膜組織20例,采用Western blot法分別檢測不同組織中wt-P53的蛋白表達(dá)。7、將表達(dá) miRNA-612 的質(zhì)粒 pSilencer/miR-612 及對照質(zhì)粒 pSileneer/NC分別轉(zhuǎn)染EC109細(xì)胞,分別采用RT-PCR方法及Western blot技術(shù)在mRNA水平及蛋白水平檢測wt-P53的表達(dá)情況。結(jié)果1、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組ESCC患者相比較,差異表達(dá)的miRNAs共16個,其中表達(dá)上調(diào)的miRNAs有9個,表達(dá)下調(diào)的miRNAs有7個。將這些miRNAs分別進(jìn)行差異倍數(shù)的分析及PAM比較,得到一種與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的miRNAs,即在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中表達(dá)上調(diào)的miRNA-612。2、經(jīng)RT-PCR驗證,與正常粘膜組織相比,ESCC組織中miRNA-612表達(dá)上調(diào),且淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組,結(jié)果與基因芯片一致。3、GO數(shù)據(jù)庫及KEGE數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn),miRNA-612預(yù)測的靶基因,生物學(xué)功能涉及的環(huán)節(jié)很多,包括細(xì)胞的生長、分化、凋亡以及轉(zhuǎn)錄、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等,從多個方面共同調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。我們選擇可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡與抑制增殖的特異性靶基因wt-P53,blast數(shù)據(jù)庫比對后顯示,wt-P53的3'UTR區(qū)存在能與miRNA-612 5'端結(jié)合的相關(guān)序列。4、抑制miRNA-612活性后,在不顯著影響細(xì)胞增殖的前提下,miRNA-612 inhibitors能夠顯著降低EC109細(xì)胞的侵襲及遷移能力,提示miRNA-612對人ESCC的發(fā)展和侵襲、轉(zhuǎn)移可能具有正性調(diào)控作用。5、Egfp熒光素酶報告載體實驗中,miR-612可以降低P53 3'UTR質(zhì)粒中綠色熒光蛋白的表達(dá),但對于P53 3' UTR突變的報告質(zhì)粒表達(dá)的綠色熒光蛋白無明顯影響,提示miRNA-612可以作用于P53的3'UTR區(qū),即P53是miRNA-612的靶基因。6、Western blot法檢測ESCC組織中wt-P53蛋白的表達(dá)水平,ESCC有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中wt-P53的表達(dá)均明顯低于正常粘膜組織(P0.05),而有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組相比亦存在顯著性差異(P0.05)。7、將 pSilencer/miRNA-612 轉(zhuǎn)染 EC109 細(xì)胞中,采用 RT-PCR 及 Western blot法分別檢測wt-P53在mRNAs水平及蛋白水平中的表達(dá),發(fā)現(xiàn)miRNA-612可以下調(diào)wt-P53的mRNAs和蛋白表達(dá)水平,miRNA-612的表達(dá)變化與wt-P53基因的表達(dá)變化呈負(fù)相關(guān)(P0.05)。結(jié)論1、經(jīng)基因芯片聯(lián)合生物信息學(xué)技術(shù)分析,篩選出一種與ESCC侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)的特異性mRNAs即miRNA-612。2、miRNA-612對人ESCC細(xì)胞的侵襲及遷移能力可能存在正調(diào)控作用。3、miRNA-612通過下調(diào)wt-P53基因的表達(dá),更加速了腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R735.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1501066