本文關(guān)鍵詞： Irisin 動(dòng)脈粥樣硬化 內(nèi)皮細(xì)胞 microRNA 氧化低密度脂蛋白　出處：《山東大學(xué)》2017年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景:動(dòng)脈粥樣硬化,一種慢性進(jìn)展性的血管病,是引起冠心病、腦梗死、外周血管病的首要原因,在全世界范圍內(nèi)具有很高的發(fā)病率和致死率。它是由多因素共同作用引起的,主要危險(xiǎn)因素有高血壓、高血脂、大量吸煙,還有糖尿病、肥胖和遺傳因素等。動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,目前尚未完全闡明,其中內(nèi)皮功能紊亂和炎癥起著至關(guān)重要的作用。內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)其細(xì)胞間緊密連接的復(fù)合體,在血液和組織之間形成了一個(gè)選擇性的透過(guò)屏障,所以內(nèi)皮的完整性是維持血管穩(wěn)態(tài)的一個(gè)基本因素。正常內(nèi)皮細(xì)胞可以調(diào)節(jié)血管緊張度及血管結(jié)構(gòu)并且分泌抗凝、抗血小板物質(zhì)和纖溶蛋白,防止細(xì)胞向血管壁粘附聚集,具有抗炎癥反應(yīng)的作用。當(dāng)受到各種有害刺激之后,病灶處的單層內(nèi)皮細(xì)胞被活化而分泌粘附分子,引起白細(xì)胞粘附,進(jìn)而引起血管損害。各種危險(xiǎn)因素可引起血管內(nèi)皮損傷進(jìn)而導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展。許多研究證實(shí)內(nèi)皮功能失調(diào)不但是始發(fā)因素,而且是動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展中的重要因素,具有足夠存活能力和增殖能力的內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)維持內(nèi)皮完整性和修復(fù)內(nèi)皮損傷至關(guān)重要。所以,維持血管內(nèi)皮完整性、改善和提高內(nèi)皮功能是治療和預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)鍵。近年來(lái)骨骼肌已經(jīng)被確定為是一個(gè)內(nèi)分泌器官。由骨骼肌在運(yùn)動(dòng)中或者運(yùn)動(dòng)后隨即分泌的細(xì)胞因子,被稱(chēng)為肌因子,介導(dǎo)了鍛煉對(duì)代謝和心血管系統(tǒng)產(chǎn)生的一些有益作用。Irisin,一種新發(fā)現(xiàn)的肌因子,是運(yùn)動(dòng)后由骨骼肌產(chǎn)生的。它主要通過(guò)促進(jìn)產(chǎn)熱基因解偶聯(lián)蛋白的表達(dá)促進(jìn)白色脂肪棕色化,從而增加能量消耗、調(diào)節(jié)葡萄糖穩(wěn)態(tài),與肥胖、胰島素抵抗等密切相關(guān)。最近,越來(lái)越多的研究證實(shí),irisin可以改善肥胖、2型糖尿病、心血管疾病患者的內(nèi)皮功能。但是,irisin在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成中的作用及其機(jī)制,尚未有報(bào)道。研究目的:1.通過(guò)建立小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型,研究irisin對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化形成的影響。2.通過(guò)體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)研究irisin對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、炎癥、凋亡的影響,并闡明其分子機(jī)制。研究方法:1.表達(dá)與純化人重組irisin蛋白。2.建立兩種小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型:單純高脂飼料喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠模型和頸總動(dòng)脈部分結(jié)扎ApoE-/-小鼠模型。單純高脂飼料喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠模型:將16只8周齡的ApoE-/-小鼠,均給予高脂飼料喂養(yǎng),在喂養(yǎng)的第四周將小鼠隨機(jī)分成兩組,每組8只,分別給予0.5μg/g體重/天irisin和等量生理鹽水腹腔注射。在喂養(yǎng)12周后,取主動(dòng)脈和主動(dòng)脈根部用4%多聚甲醛固定。頸總動(dòng)脈部分結(jié)扎ApoE-/-小鼠模型:將10只8周齡的ApoE-/-小鼠行左側(cè)頸總動(dòng)脈部分結(jié)扎,結(jié)扎后隨機(jī)分成兩組,每組5只,分別給予0.5 μg/g體重/天irisin和等量生理鹽水腹腔注射,術(shù)后4周取左側(cè)頸總動(dòng)脈用4%多聚甲醛固定。3.油紅O染色檢測(cè)irisin對(duì)小鼠主動(dòng)脈及主動(dòng)脈根部動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的影響;HE染色檢測(cè)irisin對(duì)小鼠頸總動(dòng)脈新生內(nèi)膜形成的影響。4.CD31、Ki67標(biāo)記的免疫熒光染色檢測(cè)irisin對(duì)血管內(nèi)皮增殖的影響。5.培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)。6.BrdU免疫熒光標(biāo)記法、CCK8法、MTT法檢測(cè)irisin對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響。7.microRNA(miRNA)基因芯片分析篩查irisin處理人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞后差異表達(dá)的miRNA。8.細(xì)胞、頸總動(dòng)脈RNA提取及qRT-PCR檢測(cè)相關(guān)microRNA、mRNA的表達(dá)。9.Western blot檢測(cè)irisin處理后人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞DLK1、p-ERK、p-eNOS及炎癥、凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。10.免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)irisin對(duì)血管炎癥的影響。11.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)irisin對(duì)小鼠血清炎癥因子水平的影響。12.TUNEL熒光標(biāo)記法檢測(cè)irisin對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響。13.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)irisin對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響。14.用脂質(zhì)體 Lipofectamine2000 將 microRNA126-5p(miR126-5p)的抑制劑和Dlk1的小干擾RNA(siRNA)轉(zhuǎn)染到人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。15.用50μl含有0.1mgmiR126-5p拮抗劑的F-127普郎尼克膠放在小鼠結(jié)扎后的頸總動(dòng)脈的外膜周?chē)?將miR126-5p拮抗劑轉(zhuǎn)染到頸總動(dòng)脈內(nèi)。16.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:本研究中所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次及3次以上。兩組之間比較采用Student's t檢驗(yàn),多組之間比較采用單因素方差分析后Student-Newman-Keuls檢驗(yàn)。P0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究結(jié)果:1.重組irisin可以抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成:(1)高脂飼料喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠腹腔注射irisin 8周,油紅O染色結(jié)果顯示:irisin可以抑制主動(dòng)脈和主動(dòng)脈根部粥樣斑塊的形成。(2)左側(cè)頸總動(dòng)脈部分結(jié)扎的小鼠腹腔注射irisin4周,HE染色結(jié)果顯示:irisin可以抑制頸總動(dòng)脈斑塊的形成。2.Irisin促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖:免疫熒光結(jié)果顯示irisin可以增加頸總動(dòng)脈表達(dá)Ki67的內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量。3.Irisin通過(guò)上調(diào)miR126-5p促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖:(1)BrdU免疫熒光標(biāo)記結(jié)果顯示irisin促進(jìn)HUVEC增殖。(2)CCK8實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,20nM的irisin使HUVEC增殖了約1.26倍。(3)microRNA基因芯片及qRT-PCR結(jié)果顯示irisin可以使HUVEC中miR 126-5p的表達(dá)顯著增加。(4)miR126-5p抑制劑抑制irisin誘導(dǎo)的miR126-5p表達(dá)后,BrdU免疫熒光染色和CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,miR126-5p抑制劑抑制了 irisin誘導(dǎo)的HUVEC的增殖。4.Irisin通過(guò)激活ERK信號(hào)通路促進(jìn)miR126-5p表達(dá):(1)Western blot結(jié)果顯示,irisin可以使人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中磷酸化的ERK蛋白水平升高,ERK通路的抑制劑U0126可以抑制irisin誘導(dǎo)的ERK磷酸化。(2)qRT-PCR結(jié)果顯示ERK通路的抑制劑U0126可以抑制irisin引起的miR126-5p 表達(dá)。(3)Western blot結(jié)果顯示miR126-5p抑制劑對(duì)irisin引起的ERK磷酸化無(wú)影響。5.Dlk1 是 irisin 誘導(dǎo)的 miR126-5p 的靶基因:(1)qRT-PCR結(jié)果顯示irisin可以使HUVEC中Dlk1的表達(dá)顯著增加,ADAM9、MMP7與SDF-1α表達(dá)未受影響。(2)Western blot結(jié)果顯示,irisin可以使HUVEC中Dlk1蛋白水平下降,miR126-5p抑制劑可以逆轉(zhuǎn)irisin對(duì)Dlk1表達(dá)的抑制作用。(3)CCK8實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示Dlk1的小干擾RNA可以逆轉(zhuǎn)miR126-5p抑制劑對(duì)irisin誘導(dǎo)的HUVEC增殖的抑制作用。6.抑制miR126-5p表達(dá)減弱了 irisin對(duì)頸總動(dòng)脈斑塊形成的抑制作用和對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用:(1)qRT-PCR結(jié)果顯示腹腔注射irisin 4周可以使小鼠頸總動(dòng)脈miR126-5p的表達(dá)增加約2.78倍,miR126-5p拮抗劑可以使irisin引起的小鼠頸總動(dòng)脈miR126-5p的表達(dá)降低。(2)左側(cè)頸總動(dòng)脈部分結(jié)扎的小鼠腹腔注射irisin 4周,HE染色結(jié)果顯示:miR126-5p拮抗劑可以減弱irisin對(duì)頸總動(dòng)脈斑塊形成的抑制作用。(3)免疫熒光結(jié)果顯示miR126-5p拮抗劑可以抑制irisin引起的頸總動(dòng)脈表達(dá)Ki67內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量的增加。7.irisin抑制頸總動(dòng)脈斑塊中炎性細(xì)胞的浸潤(rùn):免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示irisin可以減少頸總動(dòng)脈斑塊中CD68+巨噬細(xì)胞和CD3+T細(xì)胞的面積。8.irisin抑制頸總動(dòng)脈斑塊中炎癥相關(guān)基因的表達(dá):(1)qRT-PCR結(jié)果顯示irisin可以使頸總動(dòng)脈斑塊中IL-6、MCP-1、ICAM-1、VCAM-1的mRNA水平減少。(2)ELISA 結(jié)果顯示 irisin 可以使 ApoE-/-小鼠血清中 IL-6、MCP-1、ICAM-1、VCAM-1的蛋白表達(dá)減少。9.irisin通過(guò)抑制ROS/p38 MAPK/NF-κB信號(hào)通路抑制ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs炎癥反應(yīng):(1)qRT-PCR 結(jié)果顯示 irisin 可以抑制 ox-LDL 刺激的 HUVECs 中 IL-6、MCP-1、ICAM-1、VCAM-1 的 mRNA 水平。(2)Western blot結(jié)果顯示irisin抑制了 ox-LDL誘導(dǎo)的p38MAPK磷酸化。(3)Western blot結(jié)果顯示irisin抑制了 ox-LDL誘導(dǎo)的NF-κB p65和磷酸化的NF-κB p65表達(dá),并且使磷酸化的NF-κB P65/NF-κB p65比值降低。(4)Western blot結(jié)果顯示與ox-LDL處理組相比,irisin可以降低細(xì)胞核NF-κB p65的水平,提高細(xì)胞漿NF-κB p65的水平,抑制NF-κB p65的核移位。(5)DCFH-DA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示irisin抑制了 ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs內(nèi)ROS表達(dá)。10.irisin抑制頸總動(dòng)脈斑塊中細(xì)胞凋亡:TUNEL熒光標(biāo)記實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示irisin可以減少頸總動(dòng)脈斑塊中細(xì)胞凋亡的數(shù)量。11.irisin 減少了 ox-LDL 誘導(dǎo)的 HUVECs 凋亡:流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,irisin有效減少了 ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC凋亡。12.Irisin上調(diào)了 Bcl-2的表達(dá),下調(diào)了 Bax和Caspase-3的表達(dá):Western blot結(jié)果顯示,irisin可以使Bcl-2的表達(dá)升高,Bax和Caspase-3的表達(dá)下降。結(jié)論:1.重組irisin可以抑制高脂喂養(yǎng)8周的ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈、主動(dòng)脈根部及左側(cè)頸總動(dòng)脈部分結(jié)扎的ApoE-/-小鼠頸總動(dòng)脈中動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成。2.體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)irisin能通過(guò)上調(diào)miR126-5p促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖。3.Irisin通過(guò)激活ERK信號(hào)通路上調(diào)miR126-5p的表達(dá),進(jìn)而抑制Dlk的表達(dá)。4.重組irisin可以減少動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及炎性因子IL-6、MCP-1、ICAM-1 和 VCAM-1 的表達(dá)。5.體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)irisin通過(guò)抑制ROS/p38 MAPK/NF-κB信號(hào)通路抑制ox-LDL刺激的HUVECs炎癥反應(yīng)。6..體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)irisin抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。7.Irisin通過(guò)上調(diào)Bcl-2,下調(diào)Bax和Caspase-3的表達(dá),抑制ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC凋亡。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R543.5

【參考文獻(xiàn)】

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1 ;Caspase Family Proteases and Apoptosis[J];Acta Biochimica et Biophysica Sinica;2005年11期

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本文編號(hào)：1499547