本文關(guān)鍵詞： 高胰島素血癥 子宮內(nèi)膜容受性 子宮內(nèi)膜蛻膜化 胰島素　出處：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:激素在胚胎植入過程及妊娠的維持中均起著重要的調(diào)控作用。以往對妊娠中激素的研究多集中于雌激素和孕激素與子宮內(nèi)膜功能的關(guān)系,關(guān)于胰島素是否參與了妊娠早期子宮內(nèi)膜容受性及蛻膜化建立的研究報道甚少。現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜上存在胰島素受體。臨床高胰島素血癥的育齡婦女(如肥胖患者),大多數(shù)伴有不孕和早期流產(chǎn)。因此,本研究擬從子宮內(nèi)膜容受性和子宮內(nèi)膜蛻膜化兩個角度,探討高胰島素對早孕小鼠子宮內(nèi)膜功能的影響,以了解胰島素對妊娠過程的調(diào)節(jié),為臨床高胰島素血癥導(dǎo)致的不孕癥、自然流產(chǎn)的診斷與治療尋求新的手段。方法:1、建立高胰島素小鼠模型:實驗組采用長效胰島素長時間梯度劑量皮下注射,對照組用同等劑量生理鹽水皮下注射的方法構(gòu)建動物模型。監(jiān)測小鼠血糖及體重。23天后,采用Elisa方法對小鼠血清胰島素水平進行檢測,判斷高胰島素小鼠模型是否建立成功。2、建立小鼠妊娠模型:高胰島素小鼠模型建立成功后,將胰島素處理組和對照組的雌性小鼠與正常雄性小鼠交配,晚上8點左右合籠(雌性:雄性,2:1),次日早上8點左右檢查陰栓。看到陰栓的為妊娠第1天(d1),苦味酸標記受孕小鼠。收集d4、d5、d6、d7和d8天孕鼠子宮內(nèi)膜組織。人工誘導(dǎo)蛻膜化模型:將胰島素處理組和對照組的雌性小鼠與輸精管結(jié)扎的雄性小鼠合籠交配,次日看到陰栓的為假孕第1天(pd1)。小鼠假孕4天(pd4)一側(cè)宮角注射玉米油100μl誘導(dǎo)蛻膜化,對側(cè)宮角不注射作為對照,于pd8處死,收集子宮組織。3、高胰島素對早孕小鼠子宮內(nèi)膜功能的影響:elisa方法檢測小鼠血清胰島素、孕酮和雌二醇水平;解剖觀察子宮大體形態(tài);he染色法觀察子宮的微細結(jié)構(gòu);實時定量熒光pcr,蛋白質(zhì)印跡法和免疫組織化學(xué)檢測d4和d5天小鼠子宮內(nèi)膜容受性相關(guān)標記物esr1、esr2、pgr和hoxa10的表達及d6、d7和d8天小鼠子宮內(nèi)膜蛻膜化相關(guān)標記物pgr、esr2、bmp2和prl的表達。westernblot對mtor信號通路子宮內(nèi)膜容受性相關(guān)分子的表達進行分析。最后,計數(shù)并比較胰島素處理組與對照組孕鼠的妊娠天數(shù)及每窩幼崽數(shù)。結(jié)果:1、高胰島素小鼠模型的構(gòu)建及血清激素分析:胰島素處理組小鼠血糖及血清胰島素水平顯著高于對照組,模型構(gòu)建成功。此外,胰島素處理組小鼠血糖和homa值顯著高于對照組,提示胰島素處理組小鼠出現(xiàn)胰島素抵抗。血清激素檢測結(jié)果顯示,胰島素處理組血清e2顯著低于正常對照組(p0.05),p4顯著高于對照組(p0.05)。2、高胰島素影響妊娠早期小鼠的子宮內(nèi)膜容受性:胰島素處理組與對照組比較,d4和d5天子宮的大體形態(tài)及微細結(jié)構(gòu)沒有顯著差異,且d5天的胚胎著床點數(shù)量也沒有顯著改變(p0.05)。但是進一步檢測發(fā)現(xiàn),d4天胰島素處理組孕鼠子宮內(nèi)膜組織的esr1、pgr和hoxa10mrna表達較對照組顯著增高(p0.05),而esr2mrna表達下降。d5天胰島素處理組esr2和hoxa10mrna表達較對照組顯著增高(p0.05),esr1mrna表達較對照組顯著降低(p0.05),westernblot檢測到其蛋白表達量與基因表達一致。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示:d4天對照組esr1、esr2、pgr和hoxa10在子宮上皮細胞和基質(zhì)細胞的細胞核均顯現(xiàn)為棕黃色,表達均為陽性,胰島素處理組esr1、pgr和hoxa10為棕黑色,表達為強陽性,而esr2顯現(xiàn)棕黃色,表達為陽性。d5天對照組esr2、pgr和hoxa10在子宮上皮細胞和基質(zhì)細胞的細胞核均顯現(xiàn)為棕黃色,表達均為陽性,胰島素處理組esr2、pgr和hoxa10為棕黑色,表達為強陽性,而esr1顯現(xiàn)棕黃色,表達為陽性。3、高胰島素抑制孕鼠子宮內(nèi)膜蛻膜化:d6天胰島素處理組子宮形態(tài)與對照組比較無顯著差別,d7和d8天胰島素處理組子宮部分胚胎著床點形態(tài)與對照組相比體積變小。d6、d7和d8天胚胎著床點數(shù)量顯著減少(p0.05),且微細結(jié)構(gòu)可見部分胚層發(fā)育不全。人工誘導(dǎo)蛻膜化模型小鼠子宮形態(tài)不規(guī)則,可見胞質(zhì)空泡化的蛻膜細胞。在d6、d7和d8天人工誘導(dǎo)蛻膜化模型中,胰島素處理組孕鼠子宮蛻膜組織的prl、bmp2、pgr和esr2mrna表達均較對照組顯著降低(p0.05);westernblot檢測到prl、bmp2、pgr和esr2蛋白表達量也均較對照組顯著降低(p0.05)。pgr和esr2表達免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示:在d6、d7和d8天,對照組子宮上皮細胞和基質(zhì)細胞的細胞核均顯現(xiàn)為棕黃色,表達為陽性,而在胰島素處理組顯示淺黃色,表達為弱陽性。在d6和d7天,bmp2在d6和d7天對照組子宮上皮細胞和基質(zhì)細胞的細胞核均顯現(xiàn)為棕黃色,表達為陽性,d8天顯現(xiàn)為棕黑色,表達為強陽性,但在d6、d7和d8天胰島素處理組均顯現(xiàn)為淡黃色,表達為弱陽性。prl在d6、d7和d8天對照組子宮上皮細胞和基質(zhì)細胞的細胞核均顯現(xiàn)為棕黑色,表達為強陽性。而胰島素處理組均顯現(xiàn)為淡黃色,表達為弱陽性。4、高胰島素影響妊娠早期子宮內(nèi)膜mtor通路:對d4、d5和d6天孕鼠子宮內(nèi)膜mtor信號通路的相關(guān)蛋白mtor、p-mtor、p70s6k和p-p70s6k的檢測發(fā)現(xiàn),胰島素處理組的p-mtor和p-p70s6k蛋白表達均較對照組顯著增高(p0.05)。5、高胰島素導(dǎo)致小鼠妊娠延長和產(chǎn)仔數(shù)減少:胰島素處理組的小鼠平均妊娠天數(shù)(21±0.71天)顯著高于對照組(18±0.50天)(p0.05);胰島素處理組的小鼠平均每窩生的幼崽數(shù)量(10±0.50只)顯著低于對照組(13±1.12只)(p0.05)。結(jié)論:1、胰島素處理組小鼠血糖和homa值顯著高于對照組,提示在高胰島素的作用下,小鼠出現(xiàn)胰島素抵抗。e2顯著低于對照組,p4顯著高于對照組,提示高胰島素導(dǎo)致孕鼠體內(nèi)激素紊亂。2、胚胎植入早期可以劃分為兩個關(guān)鍵的時期:第一期,子宮處于容受胚泡的狀態(tài)以使胚泡獲得著床的能力,此期也被稱為植入“窗口期”;第二期,胚泡完全被包埋入子宮內(nèi)膜,子宮內(nèi)膜蛻膜化反應(yīng)。在植入“窗口期”,胰島素處理組孕鼠胚胎個數(shù)和子宮內(nèi)膜的微細結(jié)構(gòu)與對照組沒有顯著變化,但是子宮內(nèi)膜容受性相關(guān)基因及蛋白Esr1、Esr2、Pgr和Hoxa10表達異常,提示盡管在高胰島素的作用下胚胎可以著床,但早孕小鼠子宮內(nèi)膜容受性輕微受損。3、在子宮內(nèi)膜蛻膜化期,胰島素處理組孕鼠胚胎個數(shù)顯著減少,且部分孕鼠胚胎著床點的大體形態(tài)異常,且子宮內(nèi)膜蛻膜化的相關(guān)基因及蛋白Prl、Bmp2、Pgr和Esr2均表達異常。說明高胰島素能夠影響子宮內(nèi)膜蛻膜化。4、孕鼠血液中胰島素水平增高會導(dǎo)致延長妊娠,并且導(dǎo)致產(chǎn)仔率下降。5、胰島素處理組的孕鼠子宮內(nèi)膜p-mTOR、p-p70S6K蛋白表達顯著增強,提示mTOR信號通路可能參與了高胰島素引起的孕鼠子宮內(nèi)膜容受性受損這一過程,具體機制有待進一步研究。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R714

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