發(fā)布時(shí)間：2018-02-07 13:33

  本文關(guān)鍵詞： 睪丸 精子發(fā)生 蛋白質(zhì)組學(xué) 蛋白質(zhì)磷酸化 磷酸化激酶　出處：《南京醫(yī)科大學(xué)》2015年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：背景:精子發(fā)生是一項(xiàng)涉及精原細(xì)胞有絲分裂,精母細(xì)胞減數(shù)分裂及精子變形的復(fù)雜生物學(xué)過(guò)程。在精子發(fā)生中,這些環(huán)節(jié)受到一系列基因的調(diào)控。其中任何一個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)生錯(cuò)誤,都有可能導(dǎo)致精子發(fā)生的異常,甚至?xí)䦟?dǎo)致雄性不育,這已經(jīng)被各種來(lái)自臨床及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的數(shù)據(jù)所證實(shí)。精子發(fā)生機(jī)制非常復(fù)雜,受到轉(zhuǎn)錄水平與轉(zhuǎn)錄后水平多層次的調(diào)控。其中磷酸化修飾,一種被廣泛研究并在多種通路中發(fā)揮作用的修飾,在精子發(fā)生過(guò)程中也發(fā)揮著重要調(diào)控作用。因此,在睪丸中系統(tǒng)分析磷酸化修飾對(duì)深入研究精子發(fā)生的分子調(diào)控是十分必要的。之前的研究已經(jīng)幫助我們對(duì)磷酸化修飾在精子發(fā)生中的作用有一定的認(rèn)識(shí)。而另一方面,隨著高分辨率、大規(guī)模質(zhì)譜儀器的發(fā)展和應(yīng)用,蛋白質(zhì)組學(xué)可以幫助我們?nèi)笆降牧私饩影l(fā)生。構(gòu)建睪丸磷酸化蛋白譜系,是通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)研究精子發(fā)生中磷酸化修飾的一種直接有效的方式。然而,目前為止,小鼠中僅有3周的磷酸化蛋白質(zhì)譜系的研究,人睪丸磷酸化蛋白質(zhì)位點(diǎn)的組成及調(diào)控機(jī)制亦未見(jiàn)報(bào)道。研究方法與結(jié)果:在本研究中,我們利用高分辨率的LTQ Orbitrap Velos質(zhì)譜儀器,基于IMAC與TiO2兩種磷酸化肽段富集策略,在成年小鼠睪丸中鑒定到17829個(gè)磷酸化位點(diǎn),對(duì)應(yīng)3955個(gè)磷酸化蛋白質(zhì)。對(duì)譜系數(shù)據(jù)進(jìn)行初步分析表明,富集到的磷酸化位點(diǎn)殘基的絲氨酸(pS),蘇氨酸(pT)及酪氨酸(pY)的比例約為82%,16%及2%,共有48.31%的磷酸化位點(diǎn)在IMAC及TiO2富集中均鑒定到。通過(guò)進(jìn)一步生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)在本研究的三種(Total,IMAC及TiO2)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)均顯示為精子發(fā)生(GO:0007283)為最顯著富集。蛋白的自體磷酸化(GO:0046777)也顯示顯著富集,這些結(jié)果說(shuō)明在睪丸中,磷酸化調(diào)控是大量存在的。通過(guò)構(gòu)建睪丸中激酶及其底物磷酸化位點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)分析,我們預(yù)測(cè)了與精子發(fā)生相關(guān)的重要調(diào)控性激酶及其底物調(diào)控關(guān)系。盡管兩種富集方法鑒定得到的磷酸化位點(diǎn)只有大約50%的重合率,但對(duì)底物對(duì)應(yīng)的激酶活性程度分析結(jié)果顯示,polo-like激酶在兩種富集方法中都顯示出顯著高活性,因此,我們推測(cè)polo-like激酶在精子發(fā)生中有重要功能。通過(guò)western blot檢測(cè)PLK1激酶活性位點(diǎn)pT210磷酸化水平確定PLK1在睪丸中和其余組織中的不同活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)測(cè)結(jié)果一致,PLK1在睪丸中的活性隨著睪丸的成熟增加,并且比同周齡的其他組織中PLK1具有更高活性。體外實(shí)驗(yàn)中,在精母細(xì)胞系GC2中進(jìn)行抑制實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示PLK1-3的活性調(diào)控細(xì)胞周期。在構(gòu)建了小鼠睪丸磷酸化蛋白質(zhì)譜系的基礎(chǔ)上,調(diào)整了IMAC與TiO2富集方式與一維分離策略,進(jìn)一步對(duì)成年人睪丸的磷酸化修飾蛋白質(zhì)進(jìn)行分析,共鑒定到16364個(gè)磷酸化位點(diǎn),對(duì)應(yīng)4683個(gè)磷酸化蛋白質(zhì)。兩種方法富集到的磷酸化位點(diǎn)殘基的絲氨酸(pS),蘇氨酸(pT)及酪氨酸(pY)的比例約為86%,12%及2%。GO分析顯示,有絲分裂細(xì)胞周期(GO:0000278),基因表達(dá)(GO:0010467),RNA剪切(GO:0008380),有絲分裂(GO:0007067),蛋白質(zhì)磷酸化(GO:0006468)及精子發(fā)生(GO:0007283)均呈現(xiàn)顯著富集。對(duì)本研究中鑒定到的磷酸化位點(diǎn)構(gòu)建激酶及其底物磷酸化位點(diǎn)網(wǎng)絡(luò),結(jié)果顯示,大于60%的激酶對(duì)應(yīng)不僅一個(gè)底物,這說(shuō)明磷酸化激酶是復(fù)雜的多重調(diào)控。將小鼠睪丸磷酸化蛋白質(zhì)譜系與人睪丸磷酸化蛋白質(zhì)譜系進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)序列同源分析,結(jié)果顯示,以人睪丸磷酸化位點(diǎn)為背景,30.1%的位點(diǎn)為人和小鼠同源的磷酸化位點(diǎn),39.5%的基因可表達(dá)人和小鼠磷酸化位點(diǎn)同源的蛋白質(zhì)。成年小鼠睪丸磷酸化蛋白質(zhì)譜系及人睪丸磷酸化蛋白質(zhì)譜系的構(gòu)建,全面展現(xiàn)了精子發(fā)生的磷酸化調(diào)控,對(duì)研究磷酸化在精子發(fā)生中的作用提供了豐富的資源。激酶與底物網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建有助于更深入了解磷酸化在精子發(fā)生中的調(diào)控作用,對(duì)磷酸激酶與底物調(diào)控的機(jī)制探索提供了寶貴的線索。
[Abstract]:Background: spermatogenesis is a germ cell mitosis, complex biological processes of spermatocyte meiosis and sperm deformation. In spermatogenesis, these links are regulated by a series of genes. A part of any errors occur, are likely to lead to abnormal spermatogenesis, and even lead to male sterility and this has been confirmed by various from clinical and experimental animal model data. The mechanism of sperm is very complex and regulated by transcriptional and post transcriptional level. The multi-level phosphorylation, a widely studied and play a role in a variety of modified pathway, also plays an important regulatory role in spermatogenesis in the testis. Therefore, system analysis of phosphorylation of molecules for further study of sperm regulation is very necessary. Previous studies have helped us in the modification of phosphoric acid In spermatogenesis have a certain understanding. On the other hand, with high resolution, large-scale development and application of mass spectrometry, proteomics can help us understand the panorama of spermatogenesis. Construction of testicular protein phosphorylation by pedigree, proteomics research on spermatogenesis in a direct and effective way of phosphorylation modified. However, so far, the research of phosphorylated protein mass line only 3 weeks in mice, consisting of human testis protein phosphorylation sites and regulatory mechanisms have not been reported. The research methods and results: in this study, we use LTQ Orbitrap Velos high resolution mass spectrometer, IMAC and TiO2 two phosphate peptides enrichment strategy based on in adult mouse testes to identify 17829 phosphorylation sites, corresponding to 3955 protein phosphorylation. The pedigree data preliminary analysis showed that the enrichment of phosphorus Acidification site residues serine threonine (pS), (pT) and tyrosine (pY) ratio is about 82%, 16% and 2%, a total of 48.31% phosphorylation sites in IMAC and TiO2 concentration were identified by bioinformatics analysis. Further, the study found in three (Total, IMAC and TiO2) statistics showed spermatogenesis (GO:0007283) is the most significant enrichment. Autologous phosphorylated proteins (GO:0046777) also showed significant enrichment, these results indicate that in the testis, phosphorylation is the existence of a large number of analyses of phosphorylation sites by constructing testis kinase and its substrate phosphorylation sites of the network, we the prediction of important regulatory kinase and its substrate regulation related with sperm. Although the phosphorylation sites were identified two enrichment methods only about 50% of the coincidence rate, but the degree of substrate kinase activity analysis results corresponding to the polo- display. Like kinase in two enrichment methods showed significantly higher activity, therefore, we speculate that polo-like kinase has an important function in spermatogenesis. Determination of PLK1 activity in different tissues of testis and the other by Western blot detection of PLK1 kinase activity sites of phosphorylation of pT210. The experimental results consistent with the prediction results, the activity of PLK1 in testis with the increase in testicular maturation, and has higher activity than other organizations with PLK1 weeks of age. In vitro inhibition in spermatocyte cell line GC2, results show that the cycle activity regulation of PLK1-3 cells. In the foundation of the mouse testis protein phosphorylation system, adjust the IMAC with the enrichment of TiO2 and one-dimensional separation strategy, further analysis of protein phosphorylation in adult testis, were identified to 16364 phosphorylation sites, 4683 phosphorylated proteins corresponding to The phosphorylation site residues. Two kinds of methods to the enrichment of serine threonine (pS), (pT) and tyrosine (pY) ratio is about 86%, 12% and 2%.GO analysis showed that the mitotic cell cycle (GO:0000278), gene expression (GO:0010467), RNA shear (GO:0008380), mitosis (GO:0007067), protein phosphorylation (GO:0006468) and spermatogenesis (GO:0007283) showed a significant enrichment of phosphorylation sites in this study were identified to construct kinase and substrate phosphorylation sites of the network, showed that more than 60% of the corresponding kinase not only a substrate, indicating that phosphorylation is regulated kinase complex the mouse testis phosphorylation protein and phosphorylated protein in human testis mass line phosphorylation site sequence analysis results showed that in human testicular phosphorylation sites as the background, the 30.1% sites of phosphorylation sites homologous to human and mouse, 39.5% base Because the expression of human and mouse homologous protein phosphorylation sites. The phosphorylation of protein construction testis and adult mouse testis protein phosphorylation system, fully demonstrated the phosphorylation regulation of spermatogenesis, provide rich resources for research on phosphorylation in spermatogenesis in vitro. Construction of kinase and substrate network contribute to a more in-depth understanding of phosphate regulation in spermatogenesis, provided valuable clues to explore the mechanism of phosphate kinase and substrate regulation.

【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R321.1

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