本文關(guān)鍵詞： 胃癌 3-溴丙酮酸 檸檬酸鈉 糖酵解 凋亡　出處：《廣西醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景和目的胃癌(Gastric Cancer,GC)是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,近年來(lái),雖然手術(shù),化療、放療等取得了巨大的進(jìn)步,但胃癌的5年生存率仍不理想。因此,尋找新的治療靶點(diǎn),提高患者生存率迫在眉睫。80年前Warburg發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤細(xì)胞在有氧條件仍然更多依賴糖酵解來(lái)獲取能量(Adenosine triphosphate,ATP)。惡性腫瘤細(xì)胞的這一特點(diǎn),為抗腫瘤藥物的研究提供了一個(gè)靶點(diǎn),即我們可以通過(guò)抑制糖酵解來(lái)殺滅腫瘤細(xì)胞。糖酵解反應(yīng)中,己糖激酶(Hexokinase,HK)、磷酸果糖激酶1(6-Phosphofructokinase-l,PFK-1)、丙酮酸激酶(Pyruvate kinase,PK)通過(guò)控制反應(yīng)的關(guān)鍵步驟來(lái)調(diào)節(jié)糖酵解的速率。因此,如果藥物能抑制這些關(guān)鍵酶的活性,則可以發(fā)揮抗腫瘤的作用。3-溴丙酮酸(3-Br PA)是一種強(qiáng)烷化劑,我們課題組及其他學(xué)者的研究均顯示3-Br PA能通過(guò)結(jié)合HK的活性位點(diǎn),從而抑制該酶的活性。檸檬酸鈉(SCT)是一種常用于食品添加劑中的化合物,我們前期研究表明SCT能通過(guò)結(jié)合PFK-1的活性區(qū)域,抑制其活性。因此3-Br PA及SCT能通過(guò)抑制關(guān)鍵酶來(lái)控制糖酵解的速率,導(dǎo)致細(xì)胞供能減少。而研究已表明當(dāng)腫瘤細(xì)胞發(fā)生能量枯竭時(shí),可出現(xiàn)持續(xù)的DNA降解,線粒體膜通透性改變,引起細(xì)胞色素C(Cyt-C)的釋放,激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase),從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。通過(guò)對(duì)細(xì)胞凋亡通路的研究,能更好的揭示抗腫瘤藥物作用機(jī)制。我們前期研究已經(jīng)證明3-Br PA及SCT能抑制惡性胸膜間皮瘤及胃癌細(xì)胞增殖,但其具體作用的機(jī)制仍未完全闡明,尤其是腹腔內(nèi)應(yīng)用3-Br PA及SCT能否發(fā)揮其抗腫瘤效應(yīng)及其作用機(jī)制國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。因此,本實(shí)驗(yàn)首先使用人胃癌細(xì)胞株SGC-7901行3-Br PA及SCT的體外實(shí)驗(yàn),然后建立裸鼠胃原位移植瘤模型,腹腔內(nèi)注射3-Br PA及SCT行體內(nèi)研究。希望為胃癌治療的探索提供一些可供參考的研究依據(jù)。研究?jī)?nèi)容第一部分3-溴丙酮酸、檸檬酸鈉對(duì)胃癌細(xì)胞影響的體外實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)方法:培養(yǎng)人胃癌細(xì)胞SGC-7901,MTT法檢測(cè)3-Br PA及SCT對(duì)其增殖影響,確定體外實(shí)驗(yàn)藥物濃度。分8個(gè)實(shí)驗(yàn)組:空白對(duì)照組(Control組),陽(yáng)性對(duì)照組(5-FU組),3-Br PA低、中、高濃度組及SCT低、中、高濃度組。分別用藥后,倒置顯微鏡觀察胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)情況及形態(tài)改變;流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡和周期;Hoechst 33258染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡,激光共聚焦顯微鏡及熒光探針?lè)z測(cè)reactive oxygen species(ROS)產(chǎn)量;紫外比色法檢測(cè)HK、PFK-1、PK活性,分光光度法檢測(cè)ATP和乳酸(Lactic acid,LC)含量;Western blot(WB)檢測(cè)凋亡基因蛋白的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1.MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果:3-Br PA、SCT能呈時(shí)間及濃度依賴性抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng),3-Br PA對(duì)SGC-7901的半數(shù)抑制濃度(IC50)在24h、48h分別為9.88±1.07μg/ml、5.97±0.95μg/ml。而SCT的IC50在24h、48h分別為6.47±0.87 mg/ml、3.84±0.59 mg/ml。2.倒置顯微鏡觀察結(jié)果:3-Br PA、SCT及5-FU可顯著抑制胃癌細(xì)胞的增殖,隨著3-Br PA、SCT濃度增加,活細(xì)胞數(shù)明顯減少細(xì)胞排列稀疏,變圓,空白對(duì)照組細(xì)胞排列緊密,細(xì)胞呈多邊形。3.流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)結(jié)果:用藥24 h、48 h后,3-Br PA組及SCT組細(xì)胞凋亡率隨藥物濃度增加或作用時(shí)間延長(zhǎng)而顯著增高(P0.05)。3-Br PA組中細(xì)胞凋亡率由15.60±1.83%增加至84.45±3.97%;SCT組中從19.31±1.89%增至88.34±5.22%。5-FU組細(xì)胞凋亡率在24 h及48 h分別為61.57±4.30%及92.64±4.15%。用藥24h后,3-Br PA、SCT組及5-FU組中,G2/M期細(xì)胞數(shù)目明顯增多(P0.05),可見(jiàn)亞二倍體凋亡峰。5-FU組中,S期的細(xì)胞數(shù)也明顯增加(P0.05)。4.Hoechst 33258染色結(jié)果:3-Br PA、SCT組及5-FU組可見(jiàn)凋亡細(xì)胞明顯增多(P0.05),表現(xiàn)為核固縮或崩解,細(xì)胞呈明顯的亮藍(lán)色,凋亡率隨3-Br PA、SCT濃度的增高而增大(P0.05),而空白對(duì)照組未見(jiàn)明顯的凋亡細(xì)胞。5.ROS產(chǎn)量檢測(cè)結(jié)果:用藥4h后,3-Br PA、SCT組及5-FU組中胞內(nèi)ROS的產(chǎn)量較空白對(duì)照組明顯增多(P0.05),通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察,可見(jiàn)亮綠色細(xì)胞數(shù)量和熒光強(qiáng)度均隨著3-Br PA、SCT濃度增高而上升(P0.05)。6.細(xì)胞內(nèi)HK、PFK-1、PK活性及ATP和LC產(chǎn)量檢測(cè)結(jié)果:用藥24h、48 h后,3-Br PA組HK活性較SCT組及空白對(duì)照組均顯著降低(P0.05),且呈藥物濃度及作用時(shí)間依賴性,5-FU組中HK活性亦較SCT組和空白對(duì)照組低(P0.05)。SCT組HK活性與空白對(duì)照組相比未見(jiàn)明顯的差異(P0.05)。SCT組PFK-1活性隨藥物濃度增加及作用時(shí)間延長(zhǎng)而顯著降低(P0.05),3-Br PA組及5-FU組PFK-1活性與空白對(duì)照組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。PK活性在各實(shí)驗(yàn)組中均未見(jiàn)明顯差異(P0.05)。3-Br PA組及SCT組ATP和LC產(chǎn)量較空白對(duì)照組均明顯減少(P0.05),表現(xiàn)為時(shí)間和藥物濃度的依賴性。5-FU處理細(xì)胞8h后ATP產(chǎn)量減少,處理48h后乳酸也較空白對(duì)照組降低(P0.05)。7.WB實(shí)驗(yàn)結(jié)果:Bax、Cyt-C及Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)量隨3-Br PA及SCT藥物濃度的增加而明顯增高,而B(niǎo)cl-2、Survivin蛋白的表達(dá)則較空白組明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。5-FU組中Bcl-2、Survivin蛋白表達(dá)較空白對(duì)照組明顯降低,而B(niǎo)ax、Cyt-C及Cleavedcaspase-3則較之增高(P0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)論:3-Br PA、SCT在體外能顯著抑制人胃癌細(xì)胞株SGC-7901的增殖,導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯,抑制糖酵解關(guān)鍵么活性并通過(guò)ROS蓄積,激活線粒體凋亡通路,抑制Survivin蛋白表達(dá)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。第二部分人胃癌細(xì)胞裸鼠胃原位移植瘤模型構(gòu)建及Micro-PET/CT檢測(cè)實(shí)驗(yàn)方法:取6只雌性BALB/C裸鼠,于雙側(cè)前肢腋背部皮下注射200ul胃癌細(xì)胞懸液。待裸鼠皮下瘤長(zhǎng)至直徑約8-10mm時(shí),取出皮下移植瘤,進(jìn)行鼠間傳代,共6代。取150只雌性BALB/C裸鼠,麻醉后通過(guò)醫(yī)用OB生物膠黏貼法將腫瘤組織塊種植于胃壁漿肌層下,建立裸鼠胃原位癌模型。術(shù)后2周,隨機(jī)分成8組,每組18只,每日一次腹腔注射相應(yīng)藥物,觀察裸鼠體重、飲食及活動(dòng)度變化。連續(xù)用藥4周后,每組隨機(jī)選取6只裸鼠,利用18F-FDG作為放射性示蹤劑,行Micro-PET/CT掃描,余裸鼠用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1.成功構(gòu)建人胃癌細(xì)胞SGC-7901裸鼠胃原位移植瘤模型,成瘤率約95%。2.腹腔注射實(shí)驗(yàn)濃度的3-Br PA及SCT后,裸鼠體重緩慢增長(zhǎng),未見(jiàn)明顯飲食及活動(dòng)度下降。3.各組胃原位移植瘤病灶放射性示蹤劑集聚值(%ID/g)分別為:3-Br PA-L組2.703±0.214、3-Br PA-M組2.047±0.286、3-Br PA-H組1.348±0.142、SCT-L組2.527±0.279、SCT-M組1.975±0.245、SCT-H組1.228±0.136、5-FU組2.187±0.276、PBS組3.285±0.389。3-Br PA組及SCT組中18F-FDG集聚隨著藥物濃度的升高而減少,與PBS組對(duì)比有明顯差異(P0.05)。5-FU組中18F-FDG集聚也較PBS組降低,對(duì)比具有顯著性差異(P0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)論:通過(guò)醫(yī)用OB生物膠黏貼法可成功構(gòu)建裸鼠胃原位移植瘤模型,腹腔注射3-Br PA及SCT可安全、有效地降低腫瘤細(xì)胞代謝,抑制腫瘤生長(zhǎng)。第三部分3-溴丙酮酸、檸檬酸鈉對(duì)裸鼠胃原位移植瘤影響的體內(nèi)研究實(shí)驗(yàn)方法:構(gòu)建裸鼠胃原位移植瘤模型,連續(xù)腹腔注射相應(yīng)藥物4周后,各組隨機(jī)選取6只裸鼠,檢測(cè)血常規(guī)及肝腎功能;測(cè)量移植瘤體積及重量;HE染色觀察移植瘤組織病理形態(tài),肝腎組織病理學(xué)改變;紫外比色法檢測(cè)移植瘤HK、PFK-1、PK活性,分光光度法檢測(cè)ATP及乳酸含量;TUNEL法檢測(cè)移植瘤細(xì)胞凋亡;透視電鏡(TEM)觀察移植瘤細(xì)胞超微結(jié)構(gòu);RT-q PCR檢測(cè)相關(guān)凋亡基因m RNA表達(dá);免疫組織化學(xué)法(IHC)檢測(cè)相關(guān)凋亡蛋白表達(dá);各組余裸鼠繼續(xù)用藥至死亡,統(tǒng)計(jì)生存時(shí)間。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1.裸鼠血常規(guī)及肝腎功能:3-Br PA組及SCT組裸鼠白細(xì)胞、血紅蛋白、血小板、白蛋白、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、總膽紅素、肌酐及尿素氮與PBS組比較,均無(wú)明顯差異(P0.05);5-FU組裸鼠白細(xì)胞、血小板及白蛋白可見(jiàn)不同程度降低,而谷丙轉(zhuǎn)氨酶、總膽紅素、肌酐及尿素氮可見(jiàn)不同程度的升高,與PBS組對(duì)比均有顯著性差異(P0.05)。但各組裸鼠的血紅蛋白未見(jiàn)明顯異常(P0.05)。2.移植瘤生長(zhǎng)及裸鼠生存時(shí)間:3-Br PA組、SCT組及5-FU組移植瘤體積及重量均較PBS組減小,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),隨著3-Br PA及SCT濃度增加,其瘤體積及瘤重抑制率均增強(qiáng)。3-Br PA組,SCT組及5-FU組裸鼠生存時(shí)間均較PBS組明顯延長(zhǎng)(P0.05)。3.移植瘤HK、PFK-1、PK活性及ATP和LC產(chǎn)量:3-Br PA組HK活性隨藥物劑量增加而降低,而SCT組及PBS組未見(jiàn)明顯改變,對(duì)比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),5-FU組HK活性也較SCT組和PBS組減低(P0.05)。SCT組PFK-1活性顯著低于3-Br PA組、5-FU組及PBS組(P0.05),呈劑量依賴性改變。各組PK活性未見(jiàn)明顯差異(P0.05)。3-Br PA組、SCT組及5-FU組ATP和LC產(chǎn)量與PBS組對(duì)比,均可見(jiàn)明顯降低(P0.05),且3-Br PA組及SCT組中ATP和LC產(chǎn)量改變呈藥物濃度依賴性。4.移植瘤及肝腎組織HE染色:移植瘤組織HE染色可進(jìn)一步證明模型成功建立。3-Br PA組及SCT組裸鼠肝腎組織切片中未見(jiàn)明顯組織病理學(xué)改變,而5-FU組可見(jiàn)點(diǎn)狀壞死、細(xì)胞空泡樣改變或炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等改變。5.TUNEL染色及TEM結(jié)果:3-Br PA組及SCT組移植瘤平均凋亡指數(shù)(AI)呈劑量依賴性升高,與PBS組對(duì)比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),5-FU組AI較PBS組亦可見(jiàn)明顯增高(P0.05)。3-Br PA組、SCT組及5-FU組移植瘤細(xì)胞中可見(jiàn)典型的細(xì)胞凋亡超微結(jié)構(gòu)改變:細(xì)胞皺縮或破裂,胞核碎裂、染色質(zhì)邊聚,胞質(zhì)內(nèi)空泡形成,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫大,線粒體水腫呈空泡樣變性,線粒體嵴模糊、消失,凋亡小體形成等。而PBS組移植瘤細(xì)胞胞核較大核仁明顯,未見(jiàn)明顯凋亡變化。6.IHC結(jié)果:3-Br PA組及SCT組移植瘤中cleaved caspase-9、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)量隨藥物濃度升高而增多,與PBS組相比均可見(jiàn)明顯差異(P0.05)。此外,cleaved caspase-9、cleaved caspase-3蛋白在5-FU組中表達(dá)量亦明顯高于PBS組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。7.RT-q PCR檢測(cè)結(jié)果:3-Br PA組及SCT組移植瘤中Bax、Cyt-C m RNA表達(dá)均呈劑量依賴性升高,而B(niǎo)cl-2、Survivin的表達(dá)則呈劑量依賴性降低,與PBS對(duì)照組相比均具有顯著差異(P0.05)。同時(shí),在5-FU組移植瘤中Bax、Cyt-C也較PBS組表達(dá)增加,而B(niǎo)cl-2、Survivin表達(dá)則明顯減少(a P0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)論:腹腔內(nèi)注射3-Br PA及SCT能安全有效的抑制裸鼠原位移植瘤的生長(zhǎng)、延長(zhǎng)荷瘤鼠生存時(shí)間,誘導(dǎo)原位移植瘤細(xì)胞凋亡。全文結(jié)論:本研究分別通過(guò)內(nèi)體外實(shí)驗(yàn),研究3-BrPA及SCT對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901的影響,并探索其抗腫瘤作用機(jī)制。(1)體外實(shí)驗(yàn)表明3-Br PA及SCT可通過(guò)阻滯細(xì)胞周期,抑制糖酵解關(guān)鍵酶HK及PFK-1的活性、抑制胃癌細(xì)胞糖酵解速率、減少ATP及乳酸產(chǎn)量,導(dǎo)致細(xì)胞能量枯竭。并首次發(fā)現(xiàn)3-Br PA及SCT可促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)ROS蓄積,上調(diào)線粒體凋亡通路中Bax蛋白表達(dá),下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá),從而引起Cyt-C的釋放,激活caspase-3,同時(shí)抑制抗凋亡蛋白Survivin的表達(dá)來(lái)促進(jìn)胃癌細(xì)胞出現(xiàn)凋亡。(2)通過(guò)建立裸鼠胃原位移植瘤模型,在國(guó)內(nèi)外屬首次通過(guò)腹腔內(nèi)注射途徑應(yīng)用3-Br PA及SCT并結(jié)合18F-FDG Micro-PET/CT掃描來(lái)研究評(píng)估藥物的抗腫瘤作用,結(jié)果證實(shí)腹腔內(nèi)使用3-Br PA及SCT同樣可以抑制糖酵解酶活性,降低胃原位移植瘤組織糖酵解反應(yīng)水平,進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞能量耗竭、酸性微環(huán)境破壞,引起DNA持續(xù)降解,并上調(diào)促凋亡基因Bax、Cyt-C m RNA的表達(dá)、下調(diào)抑凋亡基因Bcl-2及Survivin m RNA的表達(dá),活化caspase-9及caspase-3來(lái)共同發(fā)揮其抗腫瘤的作用。因此,3-Br PA及SCT確實(shí)能安全有效抑制胃癌細(xì)胞,值得進(jìn)一步深入研究。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R735.2

【參考文獻(xiàn)】

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