本文關(guān)鍵詞： 神經(jīng)病理性疼痛 星形膠質(zhì)細(xì)胞 自噬 神經(jīng)炎癥 活性氧　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究目的神經(jīng)病理性疼痛是常見(jiàn)的一類慢性疼痛,發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,臨床缺乏有效治療措施。最近研究發(fā)現(xiàn),膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。星形膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)系統(tǒng)中數(shù)量最多的膠質(zhì)細(xì)胞,生理狀態(tài)下,星形膠質(zhì)細(xì)胞負(fù)責(zé)支持、分離、營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)元以及構(gòu)成血腦屏障和神經(jīng)突觸,對(duì)維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)、保護(hù)神經(jīng)元免受氧化應(yīng)激損傷具有重要作用。外周神經(jīng)損傷時(shí),星形膠質(zhì)細(xì)胞活化,一方面通過(guò)釋放多種細(xì)胞因子,如CCL7、MMP2等維持小膠質(zhì)細(xì)胞活化和神經(jīng)元敏化;另一方面,由于星形膠質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成的血腦屏障的破壞,導(dǎo)致非神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞,如T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等進(jìn)入神經(jīng)系統(tǒng),從而加劇了神經(jīng)炎癥反應(yīng)和疼痛敏化。自噬是生物學(xué)進(jìn)化保守的過(guò)程,在機(jī)體生理病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。自噬與炎癥免疫和氧化應(yīng)激關(guān)系緊密,大量文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn),自噬一方面參與抗原呈遞以及炎癥免疫的生成,另一方面自噬可以通過(guò)清除受損的蛋白質(zhì)、細(xì)胞器等抑制炎癥反應(yīng)。自噬介導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞分化與活化,而星形膠質(zhì)細(xì)胞自噬受損介導(dǎo)多種疾病的形成。在炎癥刺激誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體動(dòng)力學(xué)改變的過(guò)程中,自噬受損影響線粒體功能恢復(fù)。星形膠質(zhì)細(xì)胞自噬是否參與神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生以及調(diào)控機(jī)制尚待研究證實(shí)。本文擬探索星形膠質(zhì)細(xì)胞自噬在神經(jīng)病理性疼痛過(guò)程中的作用及其相關(guān)機(jī)制。研究方法應(yīng)用C57小鼠,L5脊神經(jīng)結(jié)扎(SNL)構(gòu)建神經(jīng)病理性疼痛模型,利用Von Frey纖維針和哈格里夫斯輻射熱儀分別檢測(cè)機(jī)械性觸誘發(fā)痛和熱痛覺(jué)過(guò)敏閾值變化。分別用ELISA法和免疫熒光標(biāo)記8-HOG分子檢測(cè)脊髓神經(jīng)炎癥水平和活性氧水平,Western blot、電鏡、免疫熒光單標(biāo)及雙標(biāo)、自噬流抑制試驗(yàn)的方法檢測(cè)SNL術(shù)后脊髓自噬水平變化。分別在神經(jīng)病理性疼痛早期階段和晚期階段鞘內(nèi)注射自噬抑制劑(3-MA)和自噬誘導(dǎo)劑(Rapamycin),檢測(cè)自噬水平改變對(duì)神經(jīng)病理性疼痛水平和脊髓神經(jīng)炎、活性氧水平影響。通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)與在體實(shí)驗(yàn)相結(jié)合,進(jìn)一步探索星形膠質(zhì)細(xì)胞自噬改變對(duì)神經(jīng)炎癥與活性氧水平影響的分子機(jī)制。結(jié)果1)SNL術(shù)后小鼠機(jī)械性觸誘發(fā)痛和熱痛覺(jué)過(guò)敏閾值降低,脊髓IL-1β、TNF-α、CCL7、MMP2以及活性氧水平升高,活性氧主要存在神經(jīng)元中。2)westernblot和免疫熒光結(jié)果顯示snl術(shù)后脊髓lc3-Ⅱ水平先增加后降低,snl3d達(dá)到峰值,snl14d恢復(fù)正常水平,而p62水平持續(xù)增加,維持至少28d。我們電鏡結(jié)果顯示snl3d脊髓組織中自噬小體顯著增加而溶酶體很少,而snl14d脊髓組織中自噬小體很少而溶酶體較多。自噬流抑制試驗(yàn)顯示snl14d脊髓組織自噬流受損。免疫熒光雙標(biāo)顯示,snl3d脊髓組織中l(wèi)c3-Ⅱ主要表達(dá)在神經(jīng)元,而snl14d組織中p62主要表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞,這一結(jié)果提示snl術(shù)后脊髓自噬流受損具有時(shí)間特異性和細(xì)胞特異性。3)雖然不論早期階段還是晚期階段,鞘內(nèi)注射自噬抑制劑(3-ma)加重神經(jīng)病理性疼痛,而鞘內(nèi)注射自噬誘導(dǎo)劑(rapamycin)緩解疼痛,但在神經(jīng)病理性疼痛不同階段抑制或者活化自噬對(duì)神經(jīng)炎癥和活性氧的影響是不同的,表現(xiàn)為在神經(jīng)病理性疼痛早期階段活化自噬降低il-1β、tnf-α水平而增加ccl7、mmp2水平,抑制自噬增加il-1β、tnf-α水平,但對(duì)ccl7、mmp2水平無(wú)影響;而在疼痛晚期階段抑制自噬增加脊髓神經(jīng)炎癥和活性氧水平,活化自噬降低神經(jīng)炎癥水平但對(duì)活性氧水平無(wú)影響。4)我們進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)nrf2至少部分參與了星形膠質(zhì)細(xì)胞自噬對(duì)脊髓神經(jīng)元活性氧的調(diào)節(jié),因?yàn)槲覀冊(cè)隗w實(shí)驗(yàn)表明,晚期階段rapamycin處理顯著降低脊髓nrf2水平,細(xì)胞實(shí)驗(yàn)同樣證明自噬活化降低星形膠質(zhì)細(xì)胞自噬水平,而通過(guò)抑制keap1活化nrf2則顯著顯著降低rapamycin處理組的活性氧水平,并且增加神經(jīng)病理性疼痛閾值,但對(duì)dmso處理組疼痛閾值無(wú)影響。5)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明抑制自噬降低il-1β、tnf-α刺激早期星形膠質(zhì)細(xì)胞來(lái)源的ccl7、mmp2水平但增加晚期星形膠質(zhì)細(xì)胞來(lái)源的ccl7、mmp2水平,jnk、nf-κb通路而非erk、p38通路介導(dǎo)了自噬抑制后晚期ccl7、mmp2水平增加,因?yàn)橐种谱允稍黾油砥趈nk、nf-κb磷酸化水平而對(duì)erk、p38磷酸化水平無(wú)影響,抑制jnk、nf-κb而非erk、p38可以顯著逆轉(zhuǎn)自噬抑制引起的晚期ccl7、mmp2水平增加。結(jié)論1)snl術(shù)后脊髓自噬流受損具有時(shí)間特異性和細(xì)胞類型特異性;2)不論早期階段還是晚期,活化自噬緩解疼痛,抑制自噬加重疼痛;3)神經(jīng)病理性疼痛不同階段活化或者抑制自噬對(duì)神經(jīng)炎癥以及活性氧的影響是不同的;4)nrf2通路至少部分參與星形膠質(zhì)細(xì)胞自噬對(duì)脊髓神經(jīng)元活性氧水平的調(diào)節(jié);5)星形膠質(zhì)細(xì)胞中,jnk、nf-κb通路而非p38、erk通路介導(dǎo)了自噬抑制所引起的晚期CCL7、MMP2水平的增加。
[Abstract]:This paper studies the role of astrocytes in the pathogenesis of neuropathic pain . The results suggest that the self - tophagocytosis of the spinal cord in the early stage of neuropathic pain significantly decreases the levels of active oxygen in the spinal cord and increases the levels of ccl7 and mmp2 . Conclusion 1 ) There is time - specific and cell - specific specificity of self - tophagocytosis in spinal cord after snl operation .

【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R402

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本文編號(hào)：1475048