本文關(guān)鍵詞： 胡椒堿 腹腔巨噬細胞(pMΦs) 哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR) 白細胞介素(IL)-6 腫瘤壞死因子(TNF)-α　出處：《暨南大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的胡椒堿是從胡椒中分離獲得的一種生物堿,具有抗腸胃炎、抗抑郁、抗癲癇和神經(jīng)保護等多種藥理學效應(yīng),但其確切的作用機制尚不清楚。本論文重點研究胡椒堿對巨噬細胞(特別是腹腔定居的巨噬細胞)功能的影響及機制。巨噬細胞是重要的固有免疫細胞,與許多慢性疾病包括動脈粥樣硬化、哮喘、炎癥性腸病(IBD)、類風濕性關(guān)節(jié)炎和纖維化等密切相關(guān)。巨噬細胞內(nèi)富含溶酶體及線粒體,具有吞噬殺菌、清除凋亡細胞碎片的能力,并在組織修復中起著重要作用。巨噬細胞的功能受到多種信號通路的精細調(diào)控以維持其自穩(wěn)態(tài)。其中mTOR不僅是細胞代謝的調(diào)控樞紐,而且能夠影響固有免疫細胞(包括單核細胞/巨噬細胞)的免疫應(yīng)答,調(diào)控炎癥相關(guān)信號通路及細胞因子表達,還能影響巨噬細胞的代謝、活化和分化過程。mTOR與其他蛋白結(jié)合所構(gòu)成的兩個復合物——mTORC1和mTORC2,擁有不同的調(diào)節(jié)活性。其中mTORC1能夠被胰島素信號和氨基酸(如亮氨酸和谷氨酰胺)代謝所激活。研究表明,腸道黏膜固有免疫穩(wěn)態(tài)的維持,依賴于腸上皮細胞對氨基酸的吸收和代謝功能,后者通過激活mTORC1調(diào)控抗菌肽的表達。有意思的是,早期的研究表明胡椒堿能促進腸上皮細胞對亮氨酸等氨基酸的吸收,提示胡椒堿可能通過增強氨基酸代謝,上調(diào)mTORC1信號,從而影響固有免疫細胞(包括巨噬細胞)的功能。為此,本論文首先利用mTOR抑制劑INK128,研究mTOR信號對巨噬細胞活化和功能的影響,同時探討胡椒堿是否通過干預(yù)mTOR信號而調(diào)節(jié)腹腔定居巨噬細胞(p MΦs)的固有免疫功能,從而闡明胡椒堿影響巨噬細胞功能的機制。該機制的闡明將為胡椒堿在炎癥性疾病等方面的臨床應(yīng)用以及相關(guān)新藥的開發(fā)提供實驗依據(jù)。方法在細胞水平上,通過WST-1試劑檢測mTOR抑制劑INK128對小鼠巨噬細胞系RAW 264.7的細胞毒性,免疫印跡法檢測細胞mTOR和NF-κB通路相關(guān)蛋白的變化,通過流式微球陣列(CBA)試劑盒檢測細胞培養(yǎng)上清中IL-6、TNF-α等細胞因子的含量,以及通過實時定量PCR(q PCR)技術(shù)檢測IL-6、TNF-α的mRNA表達水平。同時,以血清饑餓的He La和p MΦs細胞為體外模型,研究胡椒堿對亮氨酸、谷氨酰胺誘導的mTORC1活化的影響,分別通過免疫印跡法檢測mTORC1底物p70S6K的磷酸化,采用細胞免疫熒光顯微術(shù)觀察細胞內(nèi)mTOR與溶酶體蛋白LAMP2的共定位(mTORC1的激活在溶酶體表面進行)、以及細胞內(nèi)p70S6K底物p-S6的表達;胡椒堿對氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白SLC7A5/SLC3A2在細胞內(nèi)分布的影響也采用免疫熒光顯微術(shù)進行觀察,并采用小干擾RNA(si RNA)沉默SLC7A5基因后以免疫印跡法檢測p70S6K磷酸化水平。此外,采用CBA試劑盒檢測胡椒堿對p MΦs細胞分泌炎癥因子(包括IL-6、TNF-α)的影響,并用PI3K/AKT/mTOR通路抑制劑干擾細胞因子的表達。在小鼠敗血癥模型中,研究胡椒堿對腹腔注射大腸桿菌(E.coli)小鼠存活的影響,以及采用蘇木精-伊紅(HE)染色觀察肝臟和結(jié)腸組織變化,CBA試劑盒檢測腹腔灌洗液中細胞因子的表達,LB瓊脂板計數(shù)灌洗液中菌落形成單位(CFU),流式細胞儀檢測腹腔巨噬細胞對熒光標記的細菌的吞噬作用和細胞內(nèi)Caspase-3的活化情況。結(jié)果當mTOR的活性被INK128抑制時,其底物p70S6K、4E-BP1和AKTSer473的磷酸化水平下調(diào),LPS刺激巨噬細胞RAW 264.7分泌IL-6、TNF-α的能力也被抑制,表明mTOR能夠調(diào)控巨噬細胞中炎癥因子的表達。胡椒堿上調(diào)細胞內(nèi)mTORC1底物p70S6K和4E-BP1的磷酸化水平,表明胡椒堿增強mTORC1的活性,這種增強效應(yīng)依賴于亮氨酸和谷氨酰胺的存在。胡椒堿能促進細胞內(nèi)氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白SLC7A5/SLC3A2募集到細胞膜上;敲低SLC7A5的表達能明顯降低胡椒堿、亮氨酸和谷氨酰胺激活的p70S6K磷酸化水平。胡椒堿增強亮氨酸和谷氨酰胺誘導細胞內(nèi)mTOR和LAMP2的共聚集(即mTORC1活化),而該效應(yīng)也能被氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白抑制劑BCH所拮抗。這些結(jié)果表明,胡椒堿能增強氨基酸代謝所誘導的mTORC1信號。胡椒堿促進LPS刺激的p MΦs分泌IL-6、TNF-α,該促進作用可被PI3K/AKT/mTORC1通路的抑制劑所拮抗。胡椒堿灌胃能提高E.coli感染小鼠的存活率,減少細菌引起的肝臟和結(jié)腸炎癥性損傷。與溶劑組相比,在E.coli感染小鼠6 h時胡椒堿增強腹腔內(nèi)IL-6、TNF-α的表達,而感染24 h時腹腔內(nèi)IL-6、TNF-α的表達和細菌載量明顯下降。胡椒堿能阻止細菌引起的F4/80high p MΦs和F4/80highCFSE+(E.coli)p MΦs比率減少,促進對細菌的吞噬作用,抑制細菌引起的CD11bhigh/GATA6bright p MΦs的減少,并抑制CD11b+p MΦs和F4/80+p MΦs細胞內(nèi)cleaved Caspase-3的表達,而mTORC1的間接抑制劑二甲雙胍能明顯拮抗胡椒堿的上述作用。這些結(jié)果表明,胡椒堿通過調(diào)控mTORC1信號增強巨噬細胞功能,從而發(fā)揮抗感染作用。結(jié)論胡椒堿可能通過上調(diào)氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白SLC7A5/SLC3A2在細胞膜上的分布,促進亮氨酸和谷氨酰胺的吸收和代謝,從而上調(diào)mTORC1的活化,增強腹腔定居巨噬細胞在感染初期分泌炎癥因子IL-6和TNF-α,抑制腹腔定居巨噬細胞死亡,增強其吞噬功能,從而提高小鼠抵抗細菌感染和敗血癥組織損傷的能力�？傊�,胡椒堿通過促進氨基酸代謝依賴性的mTORC1活性而增強巨噬細胞的固有免疫功能,發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)和抗感染的藥理效應(yīng)。
[Abstract]:The purpose of piperine is an alkaloid obtained from the separation of pepper, with anti gastroenteritis, antidepressant, multiple antiepileptic and neuroprotective pharmacological effects, but the exact mechanism is not clear. This paper focuses on the study of piperine on macrophages (especially in peritoneal macrophages) function effect and mechanism. Macrophages are important innate immune cells, and many chronic diseases including atherosclerosis, asthma, inflammatory bowel disease (IBD), rheumatoid arthritis and fibrosis are closely related. Rich in lysosomes and mitochondria in macrophages, phagocytosis ability is, the clearance of apoptotic cell fragments, and in tissue repair plays an important role in macrophages. By regulation of multiple signaling pathways to maintain its homeostasis. The mTOR is not only the hub regulation of cell metabolism, and can affect the innate immune Cells (including monocytes / macrophages) immune response, regulate the expression of inflammation related signaling pathways and cytokines can affect the metabolism of macrophages, activation and differentiation of.MTOR and other proteins with two compound formed by mTORC1 and mTORC2, have different regulatory activity. The mTORC1 can be insulin signaling and amino acid (such as leucine and glutamine metabolism activation). The study shows that the maintenance of intestinal mucosal innate immune homeostasis, dependent on intestinal epithelial cell absorption and metabolism of amino acids, the latter through activation of mTORC1 expression regulation of antimicrobial peptides. Interestingly, early studies showed that piperine can promote the absorption of intestinal epithelial cells of leucine other amino acids, suggesting that piperine may enhance the metabolism of amino acids, up regulation of mTORC1 signal, thus affecting the innate immune cells (macrophages). Can. For this reason, this paper first use of mTOR inhibitor INK128, the effects of mTOR signal on macrophage activation and function, and explore whether piperine through the intervention of mTOR signal regulated peritoneal resident macrophages (P M s) of the innate immune function, so as to clarify the function mechanism of piperine in macrophages. The influence mechanism of development for the clinical application of piperine in inflammatory diseases and the related drug and provide experimental basis. At the cellular level, by WST-1 reagent for detection of mTOR inhibitor INK128 on the cytotoxicity of murine macrophage cell line RAW 264.7, mTOR and NF- cells to detect the changes of B pathway related protein by Western blotting, by flow cytometric bead array (CBA) kit for detection of IL-6 in the supernatant of cell culture, the content of TNF- alpha and other cytokines, and by quantitative real-time PCR (Q PCR) technology to detect IL-6, TNF- alpha mRNA The level of serum starvation. At the same time, with He La and P M with s cells as in vitro models of piperine on leucine, effect of glutamine induced mTORC1 activation, were detected by mTORC1 blotting substrate p70S6K phosphorylation, CO localization by immunofluorescence microscopy of intracellular mTOR and lysosome protein LAMP2 (the activation of mTORC1 in lysosomes, and the expression of cell surface) p70S6K substrate p-S6; effect of piperine on amino acid transporter SLC7A5/SLC3A2 in the intracellular distribution by immunofluorescence microscopy were observed, and using small interfering RNA (Si RNA) after silencing the SLC7A5 gene to detect the phosphorylation of p70S6K by Western blot. In addition, using piperine CBA kit to detect the secretion of inflammatory cytokines of P M with s cells (including IL-6, TNF- alpha) effect, and PI3K/AKT/mTOR pathway inhibitors interfere with cytokine table As in a mouse model of sepsis, Bacillus of piperine on intraperitoneal injection of Escherichia coli (E.coli) affect the survival of mice, as well as by hematoxylin eosin (HE) staining was used to observe the changes of liver and colon tissue, the expression of cytokines in peritoneal lavage fluid CBA detection kit, LB agar plate count by colony formation unit lotion in (CFU), activation of Caspase-3 cells and phagocytosis of peritoneal macrophages by flow cytometry for fluorescence labeling. The results when mTOR activity was inhibited by INK128, its substrate p70S6K, phosphorylation of 4E-BP1 and downregulation of AKTSer473, LPS stimulated the secretion of RAW 264.7 IL-6, TNF- alpha also is suppressed, show that mTOR can control the expression of inflammatory cytokines in macrophages. MTORC1 substrate p70S6K and 4E-BP1 piperine increased the intracellular phosphorylation of piperine showed enhanced mTORC1 activity, this enhanced The effect depends on the presence of leucine and glutamine. Piperine can promote the amino acid transporter SLC7A5/SLC3A2 cells recruited to the cell membrane; knockdown SLC7A5 protein can significantly reduce the piperine, phosphorylation of p70S6K leucine and glutamine. Activation of piperine enhanced copolymerization of leucine and glutamine induced intracellular mTOR and LAMP2 (set mTORC1), and the effect of activation can be antagonized by amino acid transporter inhibitor BCH. These results indicate that piperine can enhance mTORC1 signal induced by the metabolism of amino acids. Piperine enhanced LPS stimulated secretion of IL-6 P M with s, TNF- alpha, the role of PI3K/AKT/mTORC1 pathway inhibitor can be antagonized by pepper. Alkali gavage can improve the survival rate of E.coli infected mice, reduce bacterial and liver inflammatory injury. Compared with the solvent group, in mice infected with E.coli 6 h piperine Enhanced abdominal IL-6, expression of TNF-, and 24 h intraperitoneal infection of IL-6, expression of TNF- alpha and bacterial load decreased. Piperine can prevent bacteria induced by F4/80high P M with s and F4/80highCFSE+ (E.coli) P M s diameter decreased. The phagocytosis promoting to bacteria, reduce bacteria the CD11bhigh/GATA6bright P M s in diameter, and inhibit the expression of CD11b+p s and F4/80+p M M Phi Phi s cleaved in cells Caspase-3, and indirect inhibitor mTORC1 can the effect of metformin significantly antagonize piperine. These results show that piperine enhanced macrophage function by regulating mTORC1 signal, which play a role of anti infection. Conclusion pepper alkali may regulate amino acid transporter SLC7A5/SLC3A2 on cell membrane distribution, promote the absorption and metabolism of leucine and glutamine, activation and upregulation of mTORC1, enhanced peritoneal resident macrophages The secretion of inflammatory cytokines IL-6 and TNF- alpha in the early stage of infection, inhibition of peritoneal resident macrophages death, enhances phagocytic function, so as to improve the ability to resist bacterial infection and sepsis tissue injury in mice. In short, piperine and enhance the innate immune function of macrophages by promoting the metabolism of amino acid dependent mTORC1 activity and pharmacological effects of its immunomodulatory and anti infection.

【學位授予單位】：暨南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R285

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