本文關鍵詞： 骨性關節(jié)炎 關節(jié)軟骨 軟骨下骨 TGF-β1 常山酮　出處：《新疆醫(yī)科大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的:基于TGF-β1探究口服常山酮對骨性關節(jié)炎的作用及其機制:1)通過分析人膝關節(jié)脛骨平臺中關節(jié)軟骨完整與關節(jié)軟骨部分磨損標本處關節(jié)軟骨與軟骨下骨中TGF-β1表達量,初步探究TGF-β1在骨性關節(jié)炎中可能的作用;2)通過建立小鼠ACLT關節(jié)炎模型,采用口服方式給予常山酮干預,分別從軟骨及軟骨下骨角度探討常山酮對骨性關節(jié)炎的作用及TGF-β1所扮演的角色。方法:1)在人膝關節(jié)脛骨平臺標本,通過大體觀察分別選擇關節(jié)軟骨完整及關節(jié)軟骨部分磨損兩處標本,使用番紅固綠染色,OARSI-Modified Manking評分及免疫組化檢測MMP-13在關節(jié)軟骨中的表達量,驗證兩處標本中關節(jié)軟骨的狀態(tài)。通過micro-CT對比兩處標本中軟骨下骨的微觀結構,采用免疫組化分別對比兩處標本軟骨及軟骨下骨中TGF-β1的表達量;2)通過急性毒理試驗,使用Bliss法計算常山酮的半數(shù)致死量,摸索給藥劑量。將3月大C57BL/6雄性小鼠隨機分為假手術組,ALCT安慰劑組及ACLT常山酮治療組,ACLT安慰劑組通過口服灌胃方式隔日給予蒸餾水,ACLT常山酮治療組通過口服灌胃方式隔日給予對應劑量的常山酮,持續(xù)30天。術后30天及60天處死小鼠。采用番紅固綠染色及OARSI-Modified Manking評分評價小鼠關節(jié)軟骨破壞情況,通過HE染色觀察透明軟骨層及鈣化軟骨層的厚度,潮線位置是否改變。采用免疫熒光分析小鼠關節(jié)軟骨中MMP-13,Col X,TGF-β1及p-Smad2/3的表達量。用1%ITS誘導ATDC5細胞,使用阿爾新藍染色及RT-PCR鑒定誘導后ATDC5細胞成軟骨細胞。CCK-8檢測常山酮對軟骨細胞的毒性,WB檢測常山酮對軟骨細胞TGF-β1信號通路的影響;3)將3月大C57BL/6雄性小鼠隨機分為假手術組,ALCT安慰劑組及ACLT常山酮(0.25mg/kg)治療組,ACLT安慰劑組通過口服灌胃方式隔日給予蒸餾水,ACLT常山酮治療組通過口服灌胃方式隔日給予常山酮,術后30天及60天處死小鼠。通過Micro-CT分析小鼠軟骨下骨微觀結構,基于Micro-CT血管造影檢測小鼠軟骨下骨血管情況。TRAP染色觀察軟骨下骨破骨情況,免疫組化分析軟骨下骨中Osterix,p-Smad2/3及CD31表達量。結果:1)番紅固綠染色及OARSI-Modified Manking評分顯示肉眼觀關節(jié)軟骨部分磨損標本的軟骨破壞程度較肉眼觀關節(jié)軟骨完整標本更重(p0.01)。免疫組化顯示,相比于關節(jié)軟骨完整的標本,MMP-13,tgf-β1及p-smad2/3在關節(jié)軟骨部分磨損標本的關節(jié)軟骨中表達量更高,p-smad2/3在關節(jié)軟骨部分磨損標本的軟骨下骨中表達量更高(p0.01)。micro-ct顯示,與關節(jié)軟骨完整標本相比,軟骨部分磨損標本的軟骨下骨骨體積分數(shù),軟骨下骨板厚度更高,骨小梁模式因子更低(p0.01)。2)常山酮在c57bl/6雄性小鼠中的半數(shù)致死量為3.7514mg/kg,選擇0.5,0.25及0.1mg/kg作為高、中、低劑量。番紅固綠染色及oarsi-modifiedmanking評分顯示,相較于假手術組,aclt安慰劑組關節(jié)軟骨破壞程度更重,常山酮治療組關節(jié)軟骨受到保護(p0.05),但常山酮不同劑量組之間關節(jié)軟骨破壞程度無明顯差異(p0.05)。he染色結果顯示,術后1月時,各組間透明軟骨層厚度及鈣化軟骨層厚度無明顯區(qū)別(p0.05),術后2月時,與假手術組及常山酮治療組相比,aclt安慰劑組透明軟骨層厚度減小,鈣化軟骨層厚度增加,潮線上移(p0.01)。術后1月及2月,常山酮不同劑量組間透明軟骨層厚度及鈣化軟骨層厚度無明顯差異(p0.05)。免疫熒光結果顯示,術后1月時,與假手術組相比,alct安慰劑組關節(jié)軟骨中mmp-13,colx,tgf-β1及p-smad2/3表達量更高,常山酮治療后可以抑制這一現(xiàn)象(p0.05)。阿爾新藍染色顯示,atdc5細胞在1%its誘導下,隨著誘導時間的逐漸增加,染色程度逐漸加深。rt-pcr結果顯示,ii型膠原的表達量隨著誘導時間的延長逐漸增加,誘導14d時其表達量達到峰值,誘導14d至21d時其含量逐漸減少,x型膠原的表達量隨著誘導時間的延長也呈逐漸增加的趨勢,誘導14d時,x型膠原的表達量逐漸接近ii型膠原的表達量,并在21d時超過其表達量。cck-8結果顯示,常山酮對軟骨細胞毒性呈現(xiàn)濃度依賴性和時間依賴性,當其濃度大于50ng/ml時,細胞存活率將低于75%。westernblot顯示,常山酮可以抑制軟骨細胞中tgf-β1信號通路,其作用呈現(xiàn)濃度依賴性和時間依賴性。3)micro-ct顯示,術后1月及2月時,與假手術組相比,aclt安慰劑組小鼠軟骨下骨總體積及骨小梁模式因子增加,骨體積分數(shù)及軟骨下骨板的厚度減小,常山酮治療后可以抑制軟骨下骨微觀結構的異常改變(p0.05)。術后1月時,trap染色結果顯示,與假手術組相比,aclt安慰劑組軟骨下骨破骨更加活躍,常山酮治療后可以抑制異常活躍的破骨(p0.05)。免疫組化結果顯示,與假手術組相比,aclt安慰劑組軟骨下骨中osterix陽性細胞數(shù)更多,且主要分布于骨髓中(p0.01)。與假手術組相比,常山酮治療組軟骨下骨中osterix陽性細胞數(shù)無明顯差異,細胞分布于骨的表面(p0.05)。與假手術組和常山酮治療組相比,安慰劑組軟骨下骨中p-smad2/3陽性細胞數(shù)更多(p0.01),而常山酮治療組與假手術組相比無明顯差異(p0.05)�；趍icro-ct血管造影結果顯示,術后1月時,與假手術組相比,aclt安慰劑組軟骨下骨血管數(shù)量及體積均有所增加(p0.05),常山酮治療組與假手術組相比無明顯差異(p0.05)。免疫組化結果顯示,術后1月時,與假手術組相比,aclt安慰劑組軟骨下骨中cd31表達量更高,(p0.01),常山酮治療組與假手術組相比無明顯差異(p0.05)。結論:1)在人膝關節(jié)脛骨平臺標本中,關節(jié)軟骨破壞時,軟骨下骨微觀結構異常改變,軟骨及軟骨下骨中TGF-β1含量增加;2)切斷成年雄性C57BL/6小鼠前交叉韌帶可成功建立骨性關節(jié)炎模型,與假手術組相比,切斷小鼠前交叉韌帶后,膝關節(jié)穩(wěn)定性受到破壞,作用于膝關節(jié)的力發(fā)生了異常改變,關節(jié)軟骨內轉化生長因子β1表達量異常增加,引起基質金屬蛋白酶的表達增加,引起II型膠原的降解,使關節(jié)軟骨發(fā)生退變。通過口服灌胃方式給予常山酮治療時,關節(jié)軟骨中異常升高的轉化生長因子β1活性得到抑制,延緩了關節(jié)炎的進展,關節(jié)軟骨得到保護;3)建立小鼠ACLT關節(jié)炎模型后,通過口服灌胃方式給予常山酮干預時,抑制了小鼠脛骨平臺軟骨下骨中異�；钴S的骨吸收,異常升高的轉化生長因子β1活性得到抑制,骨吸收及骨形成得到偶聯(lián),異常活躍的骨重塑受到抑制,同時,異常新生血管的形成也得到抑制,穩(wěn)定了軟骨下骨的微觀結構,對關節(jié)軟骨起到保護作用。
[Abstract]:Objective : To investigate the role of TGF - 尾1 in articular cartilage and to investigate the role of TGF - 尾1 in articular cartilage . Compared with the sham operation group , the thickness of the articular cartilage and the thickness of the calcified cartilage were higher than those in the sham operation group .

【學位授予單位】：新疆醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R684.3

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本文編號：1458493