本文關(guān)鍵詞： 高糖 神經(jīng)管畸形 肌肽 葉酸 Pax3 O-GlcNAc　出處：《暨南大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：臨床研究表明,糖尿病妊娠時(shí)母體持續(xù)性的高血糖會(huì)導(dǎo)致胚胎出現(xiàn)嚴(yán)重畸形,其中常見且最嚴(yán)重的情形是出現(xiàn)神經(jīng)管畸形(neural tube defects,NTD)。然而,關(guān)于高糖致NTD的實(shí)驗(yàn)研究目前無十分理想的動(dòng)物模型,其發(fā)生機(jī)理也尚未闡明。因此,本文通過建立一個(gè)全新的高糖致NTD模型,深入探討其內(nèi)在的分子機(jī)制。同時(shí),基于此模型我們研究了內(nèi)源性小分子活性肽—肌肽(carnosine)對(duì)高糖致NTD的干預(yù)作用,并進(jìn)行了深入的機(jī)制研究。首先,我們采用雞胚胎來建立高糖致胚胎NTD的體內(nèi)模型,并從多方面驗(yàn)證此模型的有效性和準(zhǔn)確性。通過向Hamburger-Hamilton(HH)stage 7的雞胚氣室注射一系列濃度的D型葡萄糖(0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 mmol/egg)模擬胚胎發(fā)育的高糖環(huán)境,孵育至第5日,取胚記錄死亡率、體重等指標(biāo)。體式顯微鏡下檢查胚胎發(fā)育的外部表征,統(tǒng)計(jì)胚胎的NTD發(fā)生率。經(jīng)固定、切片及HE染色后檢查胚胎神經(jīng)管的內(nèi)部表征。結(jié)果顯示,高糖導(dǎo)致胚胎死亡率上升、出現(xiàn)發(fā)育遲滯以及NTD率的增加,且與高糖濃度呈劑量依賴關(guān)系。胚胎神經(jīng)管畸形的外部表征與臨床表現(xiàn)一致,呈現(xiàn)出腦膨出、無腦、小腦等畸形;HE染色顯示的內(nèi)部表征,高糖誘導(dǎo)的神經(jīng)管畸形主要表現(xiàn)為背側(cè)神經(jīng)管的閉合失敗。為確定上述損傷是通過高糖進(jìn)入胚胎體內(nèi)而造成的,我們利用PET/CT-MRI聯(lián)用技術(shù)對(duì)氣室注射的葡萄糖進(jìn)行放射性示蹤,結(jié)果發(fā)現(xiàn)外源性添加的葡萄糖被胚胎吸收入體內(nèi)代謝,且在中樞神經(jīng)系統(tǒng)有顯著分布;組織內(nèi)葡萄糖濃度檢測顯示胚胎內(nèi)的血糖及腦組織內(nèi)糖含量均隨高糖的濃度而增加;利用Real-time PCR檢測,發(fā)現(xiàn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT1及GLUT3的m RNA水平也在高糖下顯著受到抑制。最后我們確定D-Glucose的0.4 mmol/egg為造模有效劑量。此外,考慮到高糖還有可能通過誘導(dǎo)代謝旁引起高滲應(yīng)激而造起胚胎發(fā)育損傷,我們選用缺乏細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的L-Glucose進(jìn)行等滲對(duì)照實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),L-Glucose并不能顯著引起NTD的發(fā)生,且其造成的胚胎死亡、發(fā)育遲緩及組織糖含量變化遠(yuǎn)不及同劑量的D-Glucose,進(jìn)一步確定了高糖是引起胚胎發(fā)育損傷的根本原因,其伴隨的高滲作用只是次要的原因�；谖覀兘⒌母咛钦T導(dǎo)雞胚神經(jīng)管畸形模型,經(jīng)過前期篩選,我們發(fā)現(xiàn)了內(nèi)源性小分子活性肽肌肽對(duì)該模型具有干預(yù)作用。同時(shí)我們選用了孕期常用抗NTD的藥物葉酸進(jìn)行了對(duì)比實(shí)驗(yàn)。在胚胎孵育的第0 h預(yù)添加0.1、0.5、1、5、10 nmol/egg的兩種藥物,24h后(HH stage 7)給予高糖造模繼續(xù)孵育至第5天,取胚,記錄死亡率、胚重。鏡檢并記錄胚胎NTD率;經(jīng)切片、染色觀察內(nèi)部表征。結(jié)果顯示,0.1 nnmol/egg以上劑量的肌肽對(duì)高糖誘導(dǎo)的胚胎發(fā)育損傷有明顯恢復(fù)作用,胚胎NTD率顯著性地降低。對(duì)照藥物葉酸的恢復(fù)作用明顯不及肌肽,僅在5 nmol/egg劑量降低了一定的NTD率。胚胎的整體形態(tài)及神經(jīng)管橫斷切面的HE染色亦顯示肌肽能完好地修復(fù)神經(jīng)管閉合缺陷,而葉酸只能部分地修復(fù)。檢測血糖及GLUT1及3的m RNA水平時(shí)發(fā)現(xiàn)肌肽能夠顯著性恢復(fù)血糖含量及GLUTs的異常抑制狀態(tài),提示肌肽可能通過某種途徑提高了細(xì)胞的葡萄糖耐量,緩解了胞內(nèi)高糖的應(yīng)激狀態(tài)。相比之下,葉酸對(duì)于高血糖及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白均無明顯作用。Pax3蛋白是一種與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育緊密相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。其在神經(jīng)管的發(fā)育中參與了脊髓背腹側(cè)模式的形成,通過調(diào)控背側(cè)神經(jīng)元的分化和凋亡而影響神經(jīng)管的閉合。我們探討了關(guān)鍵調(diào)控因子Pax3是否參與了高糖誘導(dǎo)的NTD及肌肽的修復(fù)作用。利用免疫熒光檢測孵育了48 h的雞胚Pax3蛋白的表達(dá)分布,結(jié)果顯示高糖模型組胚胎在神經(jīng)管閉合失敗的同時(shí),Pax3蛋白的較正常組表達(dá)明顯下降。肌肽顯著性地修復(fù)了NTD與Pax3蛋白的表達(dá)。而葉酸雖然部分地修復(fù)了NTD,但對(duì)Pax3蛋白無明顯作用。為進(jìn)一步驗(yàn)證葉酸代謝與高糖誘導(dǎo)的NTD的聯(lián)系,我們還利用了葉酸的拮抗劑甲氨蝶呤(MTX)代替高糖對(duì)24 h的雞胚造模誘導(dǎo)NTD,發(fā)現(xiàn)MTX誘導(dǎo)了相似的NTD表征,但其Pax3蛋白表達(dá)水平與正常組類似。以上結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了由高糖誘導(dǎo)的NTD和與葉酸代謝異常相關(guān)的NTD有所不同,而Pax3蛋白的損失則有可能是此類NTD及肌肽特異性修復(fù)作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)。利用Western blotting檢測了3.5日胚齡雞胚的Pax3蛋白水平的變化也得到了與免疫熒光類似的結(jié)果。利用Real-time PCR檢測相關(guān)基因表達(dá),發(fā)現(xiàn)Pax3下游基因Shh、c-MET、Sox10以及NACM等基因在高糖誘導(dǎo)下下調(diào),肌肽能使之恢復(fù),但Pax3基因在高糖誘導(dǎo)下無明顯變化。對(duì)于Pax3基因與蛋白水平變化的不一致,我們推測可能是由于高糖及肌肽影響了Pax3轉(zhuǎn)錄后的某一修飾過程。我們進(jìn)一步研究了與高糖應(yīng)激相關(guān)的翻譯后修飾—O-Glc NAc修飾對(duì)Pax3蛋白的影響,探討此種營養(yǎng)感受調(diào)節(jié)機(jī)制是否參與了高糖誘導(dǎo)的Pax3蛋白降低,以及肌肽對(duì)胚胎Pax3蛋白的修復(fù)作用機(jī)制。我們檢測了雞胚中總蛋白的O-Glc NAc修飾水平以及O-Glc NAc修飾的兩種酶OGT與OGA的基因表達(dá),結(jié)果均顯示高糖能夠誘導(dǎo)O-Glc NAc修飾水平的增加,而肌肽對(duì)此修飾水平的異常有修復(fù)作用。我們進(jìn)一步利用Co-IP純化Pax3蛋白,再檢測該轉(zhuǎn)錄因子的O-Glc NAc修飾水平,顯示Pax3蛋白能被O-Glc NAc修飾,且在高糖下該修飾增加,肌肽作用下恢復(fù)。利用免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)及激光共聚焦檢測Pax3與O-Glc NAc的共定位,顯示正常胚胎中Pax3蛋白與O-Glc NAc修飾共定位于核質(zhì)連接部位。高糖作用下使Pax3的O-Glc NAc修飾水平增加,肌肽作用下有所恢復(fù)。以上結(jié)果證明了Pax3蛋白的O-Glc NAc異常增多可能參與了高糖誘導(dǎo)NTD的機(jī)制,而這也可能是肌肽修復(fù)此發(fā)育損傷的作用靶點(diǎn)之一。綜上,我們采用雞胚建立了一個(gè)高糖誘導(dǎo)NTD的新模型,深入地探討了高糖環(huán)境下胚胎NTD的形成機(jī)制,為研究糖尿病妊娠導(dǎo)致胚胎畸形的分子機(jī)制提供了新的理論依據(jù)。同時(shí),我們還證明了內(nèi)源性小分子活性肽—肌肽對(duì)高糖誘導(dǎo)的神經(jīng)管畸形的保護(hù)作用,為預(yù)防和治療此類代謝相關(guān)的胚胎疾病提供了全新的策略與思路。
[Abstract]:Clinical studies have shown that maternal persistent hyperglycemia in diabetic pregnancies results in severe abnormalities in the embryo , among which the most common and most serious cases are neural tube defects ( NTD ) . In this paper , we used the technique of PET / CT - MRI to study the effect of endogenous small molecule active peptide - carnosine on NTD . The results showed that there was no significant difference between the levels of NTD and NTD induced by high glucose . The results showed that there was no obvious effect on the growth of NTD induced by high glucose . In conclusion , we have established a new model of high glucose - induced NTD by using chicken embryo , and the mechanism of formation mechanism of NTD in high glucose environment has been established .

【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R714.256

【參考文獻(xiàn)】

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1 樊瓊;顧玉超;于文功;;O-GlcNAc修飾與腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移[J];中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào);2011年08期

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本文編號(hào)：1457561