本文關鍵詞： 鹿茸 內皮祖細胞 缺血缺氧 心臟微血管內皮細胞 心肌細胞 Akt Notch　出處：《北京中醫(yī)藥大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：研究目的:課題組前期已證實,鹿茸能夠提高心梗后心衰大鼠的心功能,降低心臟基質膠原纖維化、延緩心室重塑,調節(jié)SERCA2a表達活性,改善心肌收縮舒張功能;此外,鹿茸蛋白提取物能夠促進HUVECs的增殖。本研究擬對鹿茸蛋白進行蛋白質組學分析,依據缺血性心臟病發(fā)病機制,體外構建缺血缺氧細胞模型,明確鹿茸蛋白對缺血缺氧損傷的心臟微血管內皮細胞和心肌細胞的修復作用,同時觀察鹿茸蛋白對內皮祖細胞的調控作用,于前期研究結果的基礎上,進一步挖掘鹿茸改善心梗后心功能的作用機制——鹿茸蛋白通過保護受損的心臟微血管內皮細胞,同時影響內皮祖細胞活力,進而修復心臟微血管的損傷;鹿茸蛋白直接保護損傷的心肌細胞,減少心肌細胞凋亡。研究方法:(1)鹿茸蛋白質組學分析:應用預冷凍結合冷凍干燥技術、以水為溶劑,超聲波輔助勻漿法提取鹿茸蛋白,納升級液相色譜串聯(lián)質譜(Nano-LC-MS/MS)檢測鹿茸蛋白的成分,并進行GO功能注釋和KEGG分析。(2)鹿茸蛋白對CMECs缺血缺氧損傷的干預作用:細胞分離與鑒定應用組織酶消化法,差速貼壁原代分離培養(yǎng)SD大鼠乳鼠心臟微血管內皮細胞(Cardiac Microvascular Endothelial Cells,CMECs),CD31和vWF抗體免疫熒光鑒定原代CMECs。實驗分組實驗分為對照組、模型組和不同濃度鹿茸蛋白干預組。對照組于37°C,5%C02條件下用ECM完全培養(yǎng)基培養(yǎng),模型組給予無血清DMEM/F-12培養(yǎng)基,陽性對照組為完全DMEM/F-12 培養(yǎng)基,鹿茸蛋白干預組分別給于 0.25mg/ml、0.5 mg/ml、1 mg/ml、2 mg/ml、4 mg/ml、8 mg/ml濃度鹿茸蛋白無血清DMEM/F-12培養(yǎng)基,使用細胞缺氧制備裝置對模型組、陽性對照組及各鹿茸蛋白干預組進行缺血缺氧(Ischemia and hypoxia,IH)處理46小時。檢測指標應用MTS試劑盒檢測CMECs的活性,EdU試劑盒檢測CMECs的DNA活性,Matrigel膠檢測細胞成管能力,劃痕實驗和transwell小時檢測CMECs的遷移能力;AV-PI試劑盒流式細胞術檢測CMECs的凋亡情況,JC-1試劑盒流式細胞術檢測CMECs線粒體膜電位的變化,Western Blot檢測CMECs相關蛋白的表達水平。(3)鹿茸蛋白對CMs缺血缺氧損傷的干預作用:細胞分離與鑒定應用組織酶消化法,原代分離培養(yǎng)SD大鼠乳鼠心肌細胞(Cardiomyocytes,CMs),應用MHC抗體進行免疫熒光鑒定CMs。實驗分組分組及干預方法同(2),對細胞活性進行檢測后,保留對照組、模型組、0.25mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml鹿茸蛋白干預組,經條件摸索得到缺血缺氧處理時長為36小時。檢測指標CMs的DNA活性、凋亡情況、線粒體膜電位變化及相關信號通路關鍵因子表達水平檢測方法同(2),鏡下觀察記錄CMs收縮情況。(4)鹿茸蛋白對EPCs細胞活性的影響:細胞分離與鑒定應用密度梯度離心法從體重130g左右SD大鼠股骨和脛骨中原代分離培養(yǎng)內皮祖細胞(Endothelial Progenitor Cells,EPCs),應用CD133、VEGFR2抗體免疫熒光鑒定EPCs。實驗分組實驗分為對照組和鹿茸蛋白干預組,對照組由EGM-2完全培養(yǎng)基培養(yǎng),鹿茸蛋白干預組給予0.0625mg/ml、0.25mg/ml、lmg/ml濃度鹿茸蛋白培養(yǎng)基。檢測指標檢測EPCs的活性、成管能力、遷移能力和細胞內主要信號通路關鍵因子的表達水平,檢測方法同(2)。研究結果:(1)鹿茸蛋白粗提物的質量濃度為465.56 IMg/mg,質譜檢測鑒定到總蛋白386個,有145個未定性蛋白成分。386個蛋白的分子量分布于6.298到829.008kDa之間,74.4%的蛋白分子量位于1OkDa到20kDa之間,其次是1OOkDa到200kDa之間(12.8%)。等電點的分布在4.14到11.57之間,大部分的蛋白分布在4.0到7.0之間(68.4%)和8.0到9.0之間(12.8%)。鹿茸蛋白細胞組成分析結果顯示,130(33.7%)個蛋白質位于細胞膜上,111(28.8%)個蛋白位于細胞基質內,52(13.5%)個蛋白是細胞骨架組成成分,54(14%)個蛋白位于細胞核,39(10%)個蛋白屬于細胞外基質中的蛋白成分,14(3.6%)個蛋白是高爾基體的組成成分,12(3%)個蛋白位于內質網上,12(3%)個蛋白位于線粒體中,9(2%)個蛋白屬于核糖體成分;生物過程分析結果顯示,211個蛋白參與生物代謝過程,102個蛋白在代謝調節(jié)中發(fā)揮作用,151個蛋白參與了生物學過程中對外界刺激的反應和交互作用,110個蛋白參與了定位相關的生物學過程,14個蛋白參與了增長相關的生物學過程。此外,分析得出64個蛋白與細胞信號通路相關,其中40個蛋白參與信號的調控過程;38個蛋白參與了細胞的凋亡,27個蛋白與細胞的遷移能力相關;分子功能分析結果顯示,共有323個蛋白參與,其中228個蛋白與綁定(binding)過程相關,部分與分子功能中的蛋白重復,大部分屬于綁定功能的蛋白負責離子束縛,核苷酸、核糖核苷酸結合綁定過程。負責分子功能調節(jié)作用的有53個蛋白,另夕外,參與催化活性(catalytic activity)的有121個,參與調節(jié)酶活性(enzyme regulator activity)的有49個蛋白,參與運輸活動(transferase activity)的有28個蛋白。(2)鹿茸蛋白對CMECs缺血缺氧損傷的作用研究結果顯示,缺血缺氧處理后,CMECs的活力、DNA活性,線粒體膜電位、遷移能力和成管能力均降低;與模型組比較,鹿茸蛋白干預后CMECs的活力、DNA活性、線粒體膜電位、遷移能力和成管能力顯著升高,以0.5和1 mg/ml劑量組效果最優(yōu);缺血缺氧造成CMECs凋亡,鹿茸蛋白干預后,CMECs的凋亡率降低,以0.5、1、2mg/ml的鹿茸蛋白效果最為顯著;Western Blot結果顯示,缺血缺氧后,CMECs的Bcl-2和p-Akt表達水平下降,Bax和cleaved-caspase3的水平升高;鹿茸蛋白的干預改變了上述蛋白的變化趨勢,使Bcl-2和p-Akt的表達上調,并使Bax和cleaved-caspase3水平下降;應用LY294002后,鹿茸蛋白對上述各因子的作用被抑制。(3)鹿茸蛋白對CMs缺血缺氧損傷的作用研究結果顯示,缺血缺氧處理后,CMs的活力、DNA活性,線粒體膜電位和跳動次數均下降,鹿茸蛋白干預后,CMs的活力、DNA活性、線粒體膜電位顯著升高,以1mg/ml劑量組效果最優(yōu),鹿茸蛋白對CMs跳動的影響與模型組比較無統(tǒng)計學差異;缺血缺氧造成CMs凋亡,鹿茸蛋白干預后凋亡細胞的數量下降,0.25mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml鹿茸蛋白組間比較無統(tǒng)計學差異;WesternBlot結果顯示,缺血缺氧造成CMs的Bax和cleaved-caspase3蛋白表達水平升高,p-Akt和Bcl-2的表達水平下降,鹿茸蛋白干預后扭轉了上述蛋白的變化趨勢,Bax和cleaved-caspase3表達被抑制,p-Akt和Bcl-2表達水平上調;向細胞培養(yǎng)基中加入LY294002,鹿茸蛋白上述作用減弱。(4)鹿茸蛋白對EPCs活性的影響研究結果顯示,0.25mg/ml和1mg/ml的鹿茸蛋白在24小時、36小時和48小時觀察時間點均顯著促進EPCs的活性,但對EPCs的成管能力無明顯影響;lmg/m1鹿茸蛋白明顯促進EPCs的遷移能力,但0.0625mg/ml和0.25.g/ml鹿茸蛋白對EPCs的遷移能力無明顯影響;WestemBlot結果顯示,鹿茸蛋白呈一定濃度依賴性地增加EPCs的NICD表達水平,0.25mg/ml和1mg/ml鹿茸蛋白組Hes1的活化水平亦顯著增加,加入DAPT后,鹿茸蛋白對NICD和Hes1的作用消失;此外,與對照組比較,鹿茸蛋白呈一定濃度依賴性地增加Akt的磷酸化水平,0.25mg/ml和1mg/ml鹿茸蛋白組mTOR的磷酸化水平亦顯著增加,加入LY294002后,Akt和mTOR的磷酸化水平均下降。研究結論:1.鹿茸蛋白組成復雜,是含有豐富的具有多樣分子功能、參與多種生物過程的蛋白質混合物。2.鹿茸蛋白能夠降低缺血缺氧造成的CMECs、CMs損傷,通過調節(jié)PI3K/Akt信號通路影響凋亡相關細胞因子Bcl-2、Bax和caspase3的表達,達到對缺血缺氧情況下CMs和CMECs的保護作用。3.鹿茸蛋白對EPCs的增殖和遷移能力有一定促進作用,同時增加細胞Notch1信號通路相關蛋白Notch1和Hes1的活化及Akt/mTOR信號通路上的Akt和mTOR的磷酸化水平。研究意義:1.課題組前期已證實,鹿茸能夠改善心梗后的心功能,提高射血分數,減緩心室重塑。本研究為上述結果提供了更深一層的理論支持,研究結論提示,鹿茸蛋白可能通過保護受損的心臟微血管內皮細胞,同時影響內皮祖細胞的活力,調節(jié)二者的增殖、遷移和成管能力,進而促進損傷心臟血管的修復和再生過程;此外,鹿茸蛋白能夠直接降低心肌細胞的凋亡率,保護受損的心肌組織。2.課題組對鹿茸展開多項相關研究,旨在系統(tǒng)挖掘鹿茸在心血管疾病治療中的藥理作用,為缺血性心臟病的治療提供新的思路和方法;同時以期規(guī)范鹿茸制藥的使用,為人工合成藥物減少鹿茸的采摘和使用量提供實驗依據。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 張艷禾,朱曉俊;淺淡鹿茸藥用價值[J];特種經濟動植物;2002年09期

2 ;新西蘭鹿茸已占領全球4成市場[J];中國中醫(yī)藥信息雜志;2002年07期

3 ;鹿茸[J];中醫(yī)雜志;1957年07期

4 ;鹿茸精與煮茸水提制的鹿茸精化學成分的分析及其比較研究(第一報)[J];特產科學實驗;1975年02期

5 金順丹;;鹿茸生物化學成分的研究——鹿茸柔軟層和鹿茸精中磷脂和糖脂的測定[J];特產科學實驗;1982年03期

6 毛風志,李武軍,高松;鹿茸精對心血管的藥理作用[J];中成藥研究;1983年12期

7 孫曉波,周重楚;鹿茸精強壯作用的研究[J];中藥藥理與臨床;1987年03期

8 賀志炎;肌注鹿茸精引起體痛一例[J];中成藥研究;1987年04期

9 李春義;王文英;;鹿茸成分研究探討[J];特產研究;1990年04期

10 王本祥,周秋麗;鹿茸的化學、藥理及臨床研究進展[J];藥學學報;1991年09期

相關會議論文 前1條

1 劉偉;任慧霞;;鹿茸有效成分和藥理作用研究[A];2007年全國生化與生物技術藥物學術年會論文集[C];2007年

相關重要報紙文章 前10條

1 竺民;如何選購鹿茸（二）[N];醫(yī)藥養(yǎng)生保健報;2006年

2 技術顧問：王鶴濱;鹿茸的藥理作用[N];黑龍江日報;2004年

3 李延斌;鹿茸的藥理研究[N];中國醫(yī)藥報;2004年

4 楊鋒（副主任醫(yī)師）;補腎壯陽話鹿茸[N];上海中醫(yī)藥報;2002年

5 陳張勇;辨別真假鹿茸[N];中國醫(yī)藥報;2007年

6 孫萬吉　駐新賓記者 王金榮 記者 王天舒;朝陽之路[N];撫順日報;2009年

7 王惟恒;鹿的一身全是寶[N];中國中醫(yī)藥報;2005年

8 河北省醫(yī)藥公司 單宏權;無限“風光”在角丫[N];醫(yī)藥經濟報;2000年

9 記者 閆巨星;東豐鹿業(yè)著力市場建設[N];中國特產報;2003年

10 林木;有益于智力的中藥[N];上海中醫(yī)藥報;2000年

相關博士學位論文 前6條

1 肖響;鹿茸蛋白修復缺血缺氧誘導的心肌細胞及心臟微血管損傷的機制研究[D];北京中醫(yī)藥大學;2017年

2 嚴銘銘;人參鹿茸中蛋白多肽的純化及活性研究[D];長春中醫(yī)藥大學;2007年

3 劉春娟;鹿茸和鹿血活性多肽的研究[D];吉林大學;2012年

4 蘆春梅;鹿茸及其保健品中性激素測定的研究[D];吉林大學;2012年

5 李銀清;梅花鹿鹿茸膠原酶解物的制備及活性研究[D];長春中醫(yī)藥大學;2010年

6 周冉;鹿茸中有效成分的提取與分離關鍵技術及其抗氧化活性的研究[D];天津大學;2009年

相關碩士學位論文 前10條

1 王婧瑜;鹿茸中促細胞增殖的有效部位的研究及其主成分分析[D];吉林農業(yè)大學;2015年

2 李平;喀斯特山區(qū)不同營養(yǎng)水平梅花鹿鹿茸生長及相關基因的表達研究[D];貴州大學;2016年

3 劉唯佳;鹿茸中水溶性蛋白質的提取及鹿茸綜合利用的研究[D];吉林大學;2013年

4 高科翔;酶解鹿茸肽的制備分離純化及其抗氧化活性的研究[D];吉林大學;2009年

5 李秀娟;鹿茸新加工方法及其與傳統(tǒng)方法的比較研究[D];內蒙古農業(yè)大學;2008年

6 張傳奇;鹿茸抗肥胖活性研究[D];吉林農業(yè)大學;2013年

7 梁湖梅;鹿茸生理活性成分的減肥降脂作用研究[D];吉林農業(yè)大學;2014年

8 田麗麗;鹿茸提取物活性成分檢測及其生物效應研究[D];西北農林科技大學;2012年

9 熊和麗;鹿茸活性成分的提取分離及其抗腫瘤作用研究[D];西北農林科技大學;2007年

10 謝云;鹿茸中活性組分的分離純化與表征[D];福州大學;2006年

，

本文編號：1452443