本文關(guān)鍵詞： 鹿茸 內(nèi)皮祖細(xì)胞 缺血缺氧 心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞 心肌細(xì)胞 Akt Notch　出處：《北京中醫(yī)藥大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究目的:課題組前期已證實(shí),鹿茸能夠提高心梗后心衰大鼠的心功能,降低心臟基質(zhì)膠原纖維化、延緩心室重塑,調(diào)節(jié)SERCA2a表達(dá)活性,改善心肌收縮舒張功能;此外,鹿茸蛋白提取物能夠促進(jìn)HUVECs的增殖。本研究擬對(duì)鹿茸蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析,依據(jù)缺血性心臟病發(fā)病機(jī)制,體外構(gòu)建缺血缺氧細(xì)胞模型,明確鹿茸蛋白對(duì)缺血缺氧損傷的心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞的修復(fù)作用,同時(shí)觀察鹿茸蛋白對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞的調(diào)控作用,于前期研究結(jié)果的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步挖掘鹿茸改善心梗后心功能的作用機(jī)制——鹿茸蛋白通過(guò)保護(hù)受損的心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞,同時(shí)影響內(nèi)皮祖細(xì)胞活力,進(jìn)而修復(fù)心臟微血管的損傷;鹿茸蛋白直接保護(hù)損傷的心肌細(xì)胞,減少心肌細(xì)胞凋亡。研究方法:(1)鹿茸蛋白質(zhì)組學(xué)分析:應(yīng)用預(yù)冷凍結(jié)合冷凍干燥技術(shù)、以水為溶劑,超聲波輔助勻漿法提取鹿茸蛋白,納升級(jí)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(Nano-LC-MS/MS)檢測(cè)鹿茸蛋白的成分,并進(jìn)行GO功能注釋和KEGG分析。(2)鹿茸蛋白對(duì)CMECs缺血缺氧損傷的干預(yù)作用:細(xì)胞分離與鑒定應(yīng)用組織酶消化法,差速貼壁原代分離培養(yǎng)SD大鼠乳鼠心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞(Cardiac Microvascular Endothelial Cells,CMECs),CD31和vWF抗體免疫熒光鑒定原代CMECs。實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、模型組和不同濃度鹿茸蛋白干預(yù)組。對(duì)照組于37°C,5%C02條件下用ECM完全培養(yǎng)基培養(yǎng),模型組給予無(wú)血清DMEM/F-12培養(yǎng)基,陽(yáng)性對(duì)照組為完全DMEM/F-12 培養(yǎng)基,鹿茸蛋白干預(yù)組分別給于 0.25mg/ml、0.5 mg/ml、1 mg/ml、2 mg/ml、4 mg/ml、8 mg/ml濃度鹿茸蛋白無(wú)血清DMEM/F-12培養(yǎng)基,使用細(xì)胞缺氧制備裝置對(duì)模型組、陽(yáng)性對(duì)照組及各鹿茸蛋白干預(yù)組進(jìn)行缺血缺氧(Ischemia and hypoxia,IH)處理46小時(shí)。檢測(cè)指標(biāo)應(yīng)用MTS試劑盒檢測(cè)CMECs的活性,EdU試劑盒檢測(cè)CMECs的DNA活性,Matrigel膠檢測(cè)細(xì)胞成管能力,劃痕實(shí)驗(yàn)和transwell小時(shí)檢測(cè)CMECs的遷移能力;AV-PI試劑盒流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CMECs的凋亡情況,JC-1試劑盒流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CMECs線粒體膜電位的變化,Western Blot檢測(cè)CMECs相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。(3)鹿茸蛋白對(duì)CMs缺血缺氧損傷的干預(yù)作用:細(xì)胞分離與鑒定應(yīng)用組織酶消化法,原代分離培養(yǎng)SD大鼠乳鼠心肌細(xì)胞(Cardiomyocytes,CMs),應(yīng)用MHC抗體進(jìn)行免疫熒光鑒定CMs。實(shí)驗(yàn)分組分組及干預(yù)方法同(2),對(duì)細(xì)胞活性進(jìn)行檢測(cè)后,保留對(duì)照組、模型組、0.25mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml鹿茸蛋白干預(yù)組,經(jīng)條件摸索得到缺血缺氧處理時(shí)長(zhǎng)為36小時(shí)。檢測(cè)指標(biāo)CMs的DNA活性、凋亡情況、線粒體膜電位變化及相關(guān)信號(hào)通路關(guān)鍵因子表達(dá)水平檢測(cè)方法同(2),鏡下觀察記錄CMs收縮情況。(4)鹿茸蛋白對(duì)EPCs細(xì)胞活性的影響:細(xì)胞分離與鑒定應(yīng)用密度梯度離心法從體重130g左右SD大鼠股骨和脛骨中原代分離培養(yǎng)內(nèi)皮祖細(xì)胞(Endothelial Progenitor Cells,EPCs),應(yīng)用CD133、VEGFR2抗體免疫熒光鑒定EPCs。實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組和鹿茸蛋白干預(yù)組,對(duì)照組由EGM-2完全培養(yǎng)基培養(yǎng),鹿茸蛋白干預(yù)組給予0.0625mg/ml、0.25mg/ml、lmg/ml濃度鹿茸蛋白培養(yǎng)基。檢測(cè)指標(biāo)檢測(cè)EPCs的活性、成管能力、遷移能力和細(xì)胞內(nèi)主要信號(hào)通路關(guān)鍵因子的表達(dá)水平,檢測(cè)方法同(2)。研究結(jié)果:(1)鹿茸蛋白粗提物的質(zhì)量濃度為465.56 IMg/mg,質(zhì)譜檢測(cè)鑒定到總蛋白386個(gè),有145個(gè)未定性蛋白成分。386個(gè)蛋白的分子量分布于6.298到829.008kDa之間,74.4%的蛋白分子量位于1OkDa到20kDa之間,其次是1OOkDa到200kDa之間(12.8%)。等電點(diǎn)的分布在4.14到11.57之間,大部分的蛋白分布在4.0到7.0之間(68.4%)和8.0到9.0之間(12.8%)。鹿茸蛋白細(xì)胞組成分析結(jié)果顯示,130(33.7%)個(gè)蛋白質(zhì)位于細(xì)胞膜上,111(28.8%)個(gè)蛋白位于細(xì)胞基質(zhì)內(nèi),52(13.5%)個(gè)蛋白是細(xì)胞骨架組成成分,54(14%)個(gè)蛋白位于細(xì)胞核,39(10%)個(gè)蛋白屬于細(xì)胞外基質(zhì)中的蛋白成分,14(3.6%)個(gè)蛋白是高爾基體的組成成分,12(3%)個(gè)蛋白位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上,12(3%)個(gè)蛋白位于線粒體中,9(2%)個(gè)蛋白屬于核糖體成分;生物過(guò)程分析結(jié)果顯示,211個(gè)蛋白參與生物代謝過(guò)程,102個(gè)蛋白在代謝調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用,151個(gè)蛋白參與了生物學(xué)過(guò)程中對(duì)外界刺激的反應(yīng)和交互作用,110個(gè)蛋白參與了定位相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程,14個(gè)蛋白參與了增長(zhǎng)相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程。此外,分析得出64個(gè)蛋白與細(xì)胞信號(hào)通路相關(guān),其中40個(gè)蛋白參與信號(hào)的調(diào)控過(guò)程;38個(gè)蛋白參與了細(xì)胞的凋亡,27個(gè)蛋白與細(xì)胞的遷移能力相關(guān);分子功能分析結(jié)果顯示,共有323個(gè)蛋白參與,其中228個(gè)蛋白與綁定(binding)過(guò)程相關(guān),部分與分子功能中的蛋白重復(fù),大部分屬于綁定功能的蛋白負(fù)責(zé)離子束縛,核苷酸、核糖核苷酸結(jié)合綁定過(guò)程。負(fù)責(zé)分子功能調(diào)節(jié)作用的有53個(gè)蛋白,另夕外,參與催化活性(catalytic activity)的有121個(gè),參與調(diào)節(jié)酶活性(enzyme regulator activity)的有49個(gè)蛋白,參與運(yùn)輸活動(dòng)(transferase activity)的有28個(gè)蛋白。(2)鹿茸蛋白對(duì)CMECs缺血缺氧損傷的作用研究結(jié)果顯示,缺血缺氧處理后,CMECs的活力、DNA活性,線粒體膜電位、遷移能力和成管能力均降低;與模型組比較,鹿茸蛋白干預(yù)后CMECs的活力、DNA活性、線粒體膜電位、遷移能力和成管能力顯著升高,以0.5和1 mg/ml劑量組效果最優(yōu);缺血缺氧造成CMECs凋亡,鹿茸蛋白干預(yù)后,CMECs的凋亡率降低,以0.5、1、2mg/ml的鹿茸蛋白效果最為顯著;Western Blot結(jié)果顯示,缺血缺氧后,CMECs的Bcl-2和p-Akt表達(dá)水平下降,Bax和cleaved-caspase3的水平升高;鹿茸蛋白的干預(yù)改變了上述蛋白的變化趨勢(shì),使Bcl-2和p-Akt的表達(dá)上調(diào),并使Bax和cleaved-caspase3水平下降;應(yīng)用LY294002后,鹿茸蛋白對(duì)上述各因子的作用被抑制。(3)鹿茸蛋白對(duì)CMs缺血缺氧損傷的作用研究結(jié)果顯示,缺血缺氧處理后,CMs的活力、DNA活性,線粒體膜電位和跳動(dòng)次數(shù)均下降,鹿茸蛋白干預(yù)后,CMs的活力、DNA活性、線粒體膜電位顯著升高,以1mg/ml劑量組效果最優(yōu),鹿茸蛋白對(duì)CMs跳動(dòng)的影響與模型組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;缺血缺氧造成CMs凋亡,鹿茸蛋白干預(yù)后凋亡細(xì)胞的數(shù)量下降,0.25mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml鹿茸蛋白組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;WesternBlot結(jié)果顯示,缺血缺氧造成CMs的Bax和cleaved-caspase3蛋白表達(dá)水平升高,p-Akt和Bcl-2的表達(dá)水平下降,鹿茸蛋白干預(yù)后扭轉(zhuǎn)了上述蛋白的變化趨勢(shì),Bax和cleaved-caspase3表達(dá)被抑制,p-Akt和Bcl-2表達(dá)水平上調(diào);向細(xì)胞培養(yǎng)基中加入LY294002,鹿茸蛋白上述作用減弱。(4)鹿茸蛋白對(duì)EPCs活性的影響研究結(jié)果顯示,0.25mg/ml和1mg/ml的鹿茸蛋白在24小時(shí)、36小時(shí)和48小時(shí)觀察時(shí)間點(diǎn)均顯著促進(jìn)EPCs的活性,但對(duì)EPCs的成管能力無(wú)明顯影響;lmg/m1鹿茸蛋白明顯促進(jìn)EPCs的遷移能力,但0.0625mg/ml和0.25.g/ml鹿茸蛋白對(duì)EPCs的遷移能力無(wú)明顯影響;WestemBlot結(jié)果顯示,鹿茸蛋白呈一定濃度依賴性地增加EPCs的NICD表達(dá)水平,0.25mg/ml和1mg/ml鹿茸蛋白組Hes1的活化水平亦顯著增加,加入DAPT后,鹿茸蛋白對(duì)NICD和Hes1的作用消失;此外,與對(duì)照組比較,鹿茸蛋白呈一定濃度依賴性地增加Akt的磷酸化水平,0.25mg/ml和1mg/ml鹿茸蛋白組mTOR的磷酸化水平亦顯著增加,加入LY294002后,Akt和mTOR的磷酸化水平均下降。研究結(jié)論:1.鹿茸蛋白組成復(fù)雜,是含有豐富的具有多樣分子功能、參與多種生物過(guò)程的蛋白質(zhì)混合物。2.鹿茸蛋白能夠降低缺血缺氧造成的CMECs、CMs損傷,通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號(hào)通路影響凋亡相關(guān)細(xì)胞因子Bcl-2、Bax和caspase3的表達(dá),達(dá)到對(duì)缺血缺氧情況下CMs和CMECs的保護(hù)作用。3.鹿茸蛋白對(duì)EPCs的增殖和遷移能力有一定促進(jìn)作用,同時(shí)增加細(xì)胞Notch1信號(hào)通路相關(guān)蛋白Notch1和Hes1的活化及Akt/mTOR信號(hào)通路上的Akt和mTOR的磷酸化水平。研究意義:1.課題組前期已證實(shí),鹿茸能夠改善心梗后的心功能,提高射血分?jǐn)?shù),減緩心室重塑。本研究為上述結(jié)果提供了更深一層的理論支持,研究結(jié)論提示,鹿茸蛋白可能通過(guò)保護(hù)受損的心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞,同時(shí)影響內(nèi)皮祖細(xì)胞的活力,調(diào)節(jié)二者的增殖、遷移和成管能力,進(jìn)而促進(jìn)損傷心臟血管的修復(fù)和再生過(guò)程;此外,鹿茸蛋白能夠直接降低心肌細(xì)胞的凋亡率,保護(hù)受損的心肌組織。2.課題組對(duì)鹿茸展開(kāi)多項(xiàng)相關(guān)研究,旨在系統(tǒng)挖掘鹿茸在心血管疾病治療中的藥理作用,為缺血性心臟病的治療提供新的思路和方法;同時(shí)以期規(guī)范鹿茸制藥的使用,為人工合成藥物減少鹿茸的采摘和使用量提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R285.5

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