本文關鍵詞： 生物信息學 肥胖 生殖 差異基因 GO KEGG 肥胖 下丘腦-垂體-睪丸性腺軸 睪酮 氧化應激 生精功能 瘦素 胰島素 肥胖 下丘腦 瘦素 Kisspeptin GnRH GnIH　出處：《北京協(xié)和醫(yī)學院》2017年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：一、生物信息學方法研究高脂飲食誘導性肥胖對雄性SD大鼠新陳代謝的影響目的:應用生物信息學方法探尋高脂飲食誘導性肥胖雄性SD大鼠生理代謝改變,及肥胖對下丘腦-垂體-睪丸性腺軸可能造成的影響和途徑。方法:利用NCBI中的GEO基因芯片公共數(shù)據(jù)庫進行芯片數(shù)據(jù)搜索,搜索關鍵詞為大鼠(rat),肥胖(obesity),脂肪組織(adipose tissue),最終選擇芯片數(shù)據(jù)(GSE8700)作為分析對象。使用bioconductor包中R工具的函數(shù)及Limma程序包識別差異性表達基因(Differentlyexpressedgenes,DEGs),應用DAVID數(shù)據(jù)庫對差異表達基因進行GO富集分析和KEGG通路分析,選用String在線數(shù)據(jù)庫構建差異表達基因的PPI網(wǎng)絡。結果:通過對GSE8700進行分析,得到1014個表達差異基因,其中上調(diào)基因544個,下調(diào)基因470個。上調(diào)差異基因GO條目全部富集于生物過程(BP),主要為氧化還原、軸突生成、對肽類激素反應、對糖皮質(zhì)激素反應過程。下調(diào)差異基因GO富集于生物過程(BP),主要為女性懷孕、對有機物質(zhì)的反應、蛋白質(zhì)水解、對類固醇激素的反應、甘油三醋代謝等過程;富集于細胞組成(CC),主要為細胞外間質(zhì),細胞質(zhì),血液微球等組成;富集于分子功能(MF),主要為絲氨酸肽鏈內(nèi)切酶活性、脂肪酸結合、磷脂質(zhì)結合等功能。上調(diào)差異基因并未富集到任何KEGG通路,而下調(diào)差異基因富集到3條通路,分別為PPAR信號通路(過氧化物酶體增殖物激活型受體)、脂肪的消化和吸收通路、胰腺分泌通路。重要的節(jié)點基因為熱休克蛋白90ABl(Hsp90ab1),細胞外鈣敏感受體(Casr),趨化因子9(Cc19),受體相互作用蛋白激酶4(Ripk4),二甲基甘氨酸脫氫酶(Dmgdh),脂肪酸結合蛋白l(Fabpl),景天庚酮糖激酶(Shpk),載脂蛋白H(Apoh),膽囊收縮素受體(Cckar),谷氨酸代謝受體3(Grm3)等。結論:高脂飲食誘導性肥胖狀態(tài)下,機體營養(yǎng)物質(zhì)的新陳代謝發(fā)生了改變,尤其是脂質(zhì)代謝發(fā)生了紊亂,這是肥胖的重要特點之一。GO和KEGG結果提示肥胖狀態(tài)下機體生殖功能可能受到影響,類固醇激素、肽類激素代謝異常可能是其影響途徑。二、高脂飲食誘導性肥胖對雄性SD大鼠的神經(jīng)-生殖內(nèi)分泌代謝及生精功能的影響目的:研究肥胖對機體神經(jīng)-生殖內(nèi)分泌代謝和生精功能的影響,并探討上述影響產(chǎn)生的機制。方法:6周齡SPF級雄性SD大鼠45只,隨機分為普通對照組15只、高脂飲食組30只,分別給予普通飼料、高脂飼料喂養(yǎng)16周,最后得到對照組大鼠15只、肥胖組大鼠22只。麻醉后處死,測定大鼠體重、身長、內(nèi)臟脂肪、雙側腎臟、雙側睪丸的重量,并計算Lee指數(shù)、脂肪系數(shù)、腎臟系數(shù)、睪丸系數(shù)。腹主動脈取血,使用放射免疫法測定:Leptin、GLU、LH、FSH、T、E2,使用酶聯(lián)免疫法測定:GnRH、GnIH、SHBG、TC、TG,并根據(jù)相關公式計算 GnRH/GnIH、E2/T、cFT、FTI。將大鼠左側睪丸固定制作石蠟切片,HE染色觀察生精小管組織學改變并記Johnsen評分,Tunel法測定睪丸組織生精細胞凋亡率。將大鼠右側睪丸于冰上勻漿,測定睪丸組織的SOD活力及MDA含量。制作附睪尾部精子懸液,使用漢密爾頓計數(shù)儀測定精子數(shù)、活力、前向運動精子百分比。結果:在22周末,高脂飲食肥胖組大鼠(N=22)較對照組大鼠(N=15)體重明顯升高[(552.93±7.76)gvs(622.91±7.26)g],差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)。與對照組比較,肥胖組大鼠Lee指數(shù)、脂肪系數(shù)、血清Leptin、INS、TG明顯增高(P0.05),而腎臟系數(shù)、睪丸系數(shù)明顯降低(P0.05)。與對照組比較,肥胖組大鼠GnRH、GnRH/GnIH比值、LH、TT、SHBG、FTI、cFT明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),E2、E2/T比值明顯升高(P0.05)。與對照組比較,肥胖組大鼠睪丸組織HE染色顯示睪丸生精小管未見明顯萎縮,但生精小管常見“空泡樣”改變,且生精細胞排列偶見紊亂、層次減少,其睪丸組織Jhosen評分較對照組未見明顯降低(P0.05)。與對照組相比,肥胖組大鼠睪丸生精細胞TUNEL法顯示凋亡增加,凋亡指數(shù)計數(shù)[(3.09±0.28)vs(4.26±0.35)%]降低,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。與對照組比較,肥胖組大鼠睪丸組織勻漿液SOD活力[(62.57±4.64)vs(47.20±3.05)U/mgprot]降低,MDA 濃度[(2.94±0.443)vs(4.18±0.38)nmol/mgprot]升高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。與對照組比較,肥胖組大鼠附睪精子數(shù)目[(30.07±2.72)×106/ml vs(24.64±1.53)×106/ml],差異無統(tǒng)計學意義(P0.05);精子活力[(36.40±9.17)%vs(14.36±7.67)%],差異有明顯統(tǒng)計學意義(P0.05);前向運動精子百分比明顯下降[(12.80±3.05)%vs(5.27±3.14)%],差異有明顯統(tǒng)計學意義(P0.05)。結論:高脂飲食誘導的肥胖大鼠出現(xiàn)了體重增加、脂肪堆積、瘦素抵抗、胰島素抵抗、脂質(zhì)代謝紊亂等代謝改變。高脂飲食誘導性肥胖SD雄性大鼠下丘腦-垂體-睪丸軸代謝活動發(fā)揮了抑制作用,表現(xiàn)為血清GnRH、LH、T、cFT、SHBG明顯降低,而E2明顯升高。高脂飲食誘導的肥胖可能對睪丸組織以功能性損害為主,短時間內(nèi)對生精小管組織形態(tài)的器質(zhì)性改變較小,但長期來看可能會對其生精小管組織形態(tài)結構上造成損害。高脂飲食誘導的營養(yǎng)性肥胖大鼠睪丸組織生精細胞凋亡指數(shù)增加,并氧化應激水平提高,最終導致精子活力下降。三、高脂飲食誘導性肥胖導致雄性SD大鼠的下丘腦Kisspeptin-GnRH系統(tǒng)代謝下調(diào)目的:研究肥胖對下丘腦生殖調(diào)控中樞的影響及可能調(diào)控機制。方法:通過高脂飲食誘導建立肥胖大鼠模型,將對照組(N=18)和肥胖組(N=18)大鼠麻醉后,進行下丘腦取材。采用免疫組化染色法測定下丘腦中LepR、Kisspeptin、KisslR、GnRH 和 GnIH 的定位和表達變化;Westem-Blot 法檢測 LepR、Kisspeptin、Kiss1R、GnRH、GnIH 的蛋白表達變化;Real-timePCR 法檢測 LepR、Kiss1、Kiss1R、GnRH、GnIH的mRNA表達變化。結果:免疫組化結果顯示,對照組和肥胖組大鼠的下丘腦LepR陽性著色見于細胞核的棕黃色著色,而Kisspeptin、Kiss1R、GnRH和GnIH其陽性信號均見于細胞質(zhì)的棕黃色著色。相比較對照組,肥胖組大鼠其下丘腦弓狀核LepR、Kisspeptin和GnRH表達顯著減少,但兩組Kiss1R和GnIH表達均無顯著變化。Westem-Blot結果顯示,較對照相比,LepR、Kisspeptin、KisslR、GnRH、GnIH在下丘腦均有陽性條帶表達。灰度值分析結果顯示,肥胖組大鼠LepR、Kisspeptin、GnRH蛋白表達明顯下降,較對照組差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),而Kiss1R、GnIH表達未見明顯差異(P0.05)。qRT-PCR的結果顯示,肥胖組大鼠LepR、Kisspeptin、GnRH的mRNA表達明顯下降,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),而Kiss1R、GnIH的mRNA表達末見明顯差異(P0.05)。結論:高脂飲食誘導的肥胖導致大鼠下丘腦LepR明顯降低、瘦素抵抗,最終導致Kisspeptin-GnRH分泌下調(diào)。肥胖對下丘腦-垂體-睪丸性腺軸產(chǎn)生的負性調(diào)節(jié)作用主要以Kisspeptin促進作用下調(diào)導致GnRH分泌減少為主實現(xiàn),而并非以下丘腦生殖調(diào)控中樞的GnIH抑制作用上調(diào)實現(xiàn)。
[Abstract]:The effects of high fat diet induced obesity on metabolism of male SD rats were studied by bioinformatics . The effects of obesity on the metabolism of nerve - reproductive endocrine and spermatogenic function in male SD rats were studied . Results : Compared with the control group , the rat testis tissue homogenate SOD activity was significantly higher than that in the control group ( P0.05 ) . The effects of obesity on hypothalamic - pituitary - testis axis metabolism in hypothalamus - pituitary - testis of male SD rats were studied by immunohistochemical staining . There was no significant difference in the expression of Kiss1R , Kisspeptin , and GnRH in the hypothalamus - pituitary - testis .

【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R589.2

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本文編號：1443792