本文關(guān)鍵詞： 抗炎作用 骨吸收 人牙周膜細(xì)胞 牙周病 蛋白酶體抑制劑　出處：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：牙周病是口腔常見病,也是成人牙齒脫落的主要原因。細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物是牙周病的啟動(dòng)因子。脂多糖(LPS)是革蘭氏陰性菌外膜的主要成分,在牙周病的發(fā)生與發(fā)展中扮演著重要角色。LPS刺激宿主細(xì)胞,激活炎癥相關(guān)信號(hào)通路,如核因子κB(NF-κB)信號(hào)通路、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路,導(dǎo)致大量炎癥因子的過量表達(dá)和釋放,從而引起組織炎癥反應(yīng)。泛素蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)介導(dǎo)的蛋白降解是機(jī)體調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)蛋白水平與功能的一個(gè)重要機(jī)制,參與信號(hào)傳導(dǎo)、凋亡、細(xì)胞周期和抗原呈遞等調(diào)控。參與牙周炎癥反應(yīng)的NF-κB和MAPK信號(hào)通路同樣受到UPS的調(diào)控。針對(duì)UPS調(diào)控機(jī)制,蛋白酶體抑制劑得到廣泛關(guān)注,最早用于腫瘤的研究。Bortezomib是第一個(gè)被用于臨床治療多發(fā)性骨髓瘤的蛋白酶體抑制劑,近年來,逐漸被用于非腫瘤性疾病的研究。課題組成員前期研究發(fā)現(xiàn)bortezomib能夠通過抑制泛素連接酶的關(guān)鍵抑制因子-去泛素化酶頭帕腫瘤綜合征蛋白(CYLD)的降解,而抑制破骨細(xì)胞的分化。此外,bortezomib還能夠促進(jìn)鼠牙周膜細(xì)胞的細(xì)胞分化和礦化。這些研究均表明bortezomib有望成為治療牙周病的有效藥物。然而蛋白酶體抑制劑對(duì)牙周病的治療假設(shè)仍有較多的基礎(chǔ)科研問題尚未闡明,首先是藥物安全性和組織特異性。蛋白酶體抑制劑所產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)具有明顯的組織差異性和濃度依耐性。相同濃度的蛋白酶體抑制劑對(duì)不同組織細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生不同效應(yīng),不同濃度蛋白酶體抑制劑對(duì)相同組織細(xì)胞甚至?xí)a(chǎn)生相反效果。牙周膜細(xì)胞(PDLCs)是牙周組織改建和維持牙周健康的重要細(xì)胞。由上可見,蛋白酶體抑制劑在牙周病治療領(lǐng)域作為藥物開發(fā)具有極高的潛力。然而,需要對(duì)蛋白酶體抑制劑對(duì)牙周膜細(xì)胞的藥物安全性、組織特異性、作用機(jī)理等進(jìn)行系統(tǒng)研究。所以本研究在課題組前期研究的基礎(chǔ)上,通過體外研究探討bortezomib對(duì)牙周膜細(xì)胞的藥物安全性、抗炎作用及其可能的作用機(jī)制;通過LPS聯(lián)合結(jié)扎術(shù)構(gòu)建大鼠牙周炎模型,進(jìn)一步探討bortezomib的體內(nèi)抗炎效果,以期為蛋白酶體抑制劑治療牙周病的科研成果轉(zhuǎn)化提供有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)共分為以下六個(gè)部分:第一部分人牙周膜細(xì)胞的原代培養(yǎng)及生物學(xué)特性鑒定目的:原代培養(yǎng)和鑒定h PDLCs,為后期體外實(shí)驗(yàn)提供細(xì)胞保障。方法:收集12至15歲患者因正畸治療拔除的健康前磨牙,采用組織塊酶消化法原代培養(yǎng)h PDLCs。采用免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫熒光、細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的生物學(xué)特性。結(jié)果h PDLCs呈成纖維樣,波形蛋白表達(dá)陽性,角蛋白表達(dá)陰性;14天即可見細(xì)胞集聚生長,克隆形成;連續(xù)9天生長曲線成“S”形。結(jié)論:組織塊酶消化法可以成功培養(yǎng)出h PDLCs,細(xì)胞為中胚層間充質(zhì)細(xì)胞,無上皮細(xì)胞的污染,克隆及增殖能力強(qiáng)。第二部分蛋白酶體抑制劑bortezomib對(duì)人牙周膜細(xì)胞的藥物安全性研究目的:了解Bortezomib對(duì)h PDLCs的藥物安全性,同時(shí)為后期實(shí)驗(yàn)篩選出安全實(shí)驗(yàn)濃度。方法:本實(shí)驗(yàn)通過細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞凋亡和周期實(shí)驗(yàn)檢測(cè)bortezomib(0-10n M)對(duì)h PDLCs增殖活力、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響,通過western blot、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)bortezomib(0.25 n M、0.5 n M和1 n M)在LPS刺激下,對(duì)h PDLCs中caspase3和cyclin D1基因和蛋白表達(dá)的影響,以及對(duì)h PDLCs增殖活性的影響。結(jié)果:4 n M及以下濃度的bortezomib不會(huì)影響h PDLCs的增殖,然而會(huì)使h PDLCs停留在G1期,10 n M以下濃度的bortezomib不會(huì)影響h PDLCs的凋亡。在LPS刺激下,1 n M以內(nèi)的bortezomib對(duì)h PDLCs的增殖無明顯影響,但抑制cyclin D1基因和蛋白的過表達(dá),抑制caspase3基因表達(dá),輕度抑制cleaved-caspase3蛋白表達(dá),表明bortezomib抑制h PDLCs的過度增殖和凋亡。結(jié)論:1n M以內(nèi)的bortezomib對(duì)h PDLCs表現(xiàn)出良好的藥物安全性。本研究采用0.25 n M、0.5 n M和1 n M的bortezomib進(jìn)行后續(xù)體外實(shí)驗(yàn)。第三部分Bortezomib對(duì)LPS誘導(dǎo)的人牙周膜細(xì)胞炎癥反應(yīng)抑制作用目的:本實(shí)驗(yàn)通過分析在LPS刺激下,bortezomib對(duì)h PDLCs中炎癥因子基因表達(dá)和蛋白分泌的影響,探討bortezomib的體外抗炎作用。方法:Bortezomib(0.25 n M、0.5 n M和1 n M)預(yù)處理h PDLCs 1 h,再與1μg/m L LPS共同干預(yù)h PDLCs 3、6、12和24 h,采用RT-PCR檢測(cè)腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)和白介素-8(IL-8)的基因表達(dá),酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)方法檢測(cè)TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的蛋白分泌量。結(jié)果:LPS處理h PDLCs3 h到24 h,均會(huì)促進(jìn)炎癥因子(TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8)基因的表達(dá),其中LPS作用6 h后的基因相對(duì)表達(dá)量最高。0.25 n M至1 n M濃度的bortezomib預(yù)處理可以明顯抑制LPS刺激細(xì)胞引起的炎癥因子的基因表達(dá)量和蛋白分泌量的增加。結(jié)論:0.25n M至1n M濃度的bortezomib對(duì)LPS所誘導(dǎo)的體外牙周細(xì)胞炎癥反應(yīng)表現(xiàn)出明顯的抗炎作用,表明bortezomib的體外有效抗炎濃度在皮摩爾級(jí)。提示bortezomib在牙周病的防治方面具有深入研究價(jià)值。第四部分Bortezomib通過NF-κB信號(hào)通路對(duì)人牙周膜細(xì)胞炎癥反應(yīng)抑制作用目的:本實(shí)驗(yàn)通過研究在LPS刺激下,bortezomib對(duì)h PDLCs中NF-κB信號(hào)通路活性的影響,探討bortezomib在牙周病治療方面的抗炎機(jī)制。方法:Bortezomib(0.25 n M、0.5 n M和1 n M)預(yù)處理h PDLCs6 h或者1 h,再與1μg/m L LPS共同干預(yù)h PDLCs 0.5 h或者6 h,采用western blot方法檢測(cè)NF-κB信號(hào)通路上重要的抑制因子IκBa總蛋白和磷酸化水平,免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NF-κB/p65核移情況。結(jié)果:(1)LPS處理h PDLCs 0.5 h時(shí),IκBa的蛋白水平與磷酸化水平稍有下調(diào),但與空白對(duì)照組間比較沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;當(dāng)bortezomib預(yù)處理細(xì)胞6 h時(shí),IκBa的蛋白水平與磷酸化水平均隨著bortezomib濃度的增加而增加。(2)Bortezomib預(yù)處理h PDLCs 1 h,再與LPS共同作用細(xì)胞6 h時(shí),LPS能夠顯著增加IκBa的磷酸化水平和促進(jìn)IκBa蛋白水平的上調(diào);IκBa蛋白水平與磷酸化水平均有隨著bortezomib濃度增加而增加的趨勢(shì)。(3)免疫熒光結(jié)果顯示:NF-κB/p65定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi),當(dāng)LPS刺激細(xì)胞0.5 h和6 h時(shí),NF-κB/p65移位進(jìn)入細(xì)胞核,bortezomib預(yù)處理能夠抑制這一反應(yīng)過程。結(jié)論:Bortezomib可以通過抑制IκBa蛋白的降解,抑制NF-κB/p65的核移,進(jìn)而調(diào)控NF-κB信號(hào)通路的活性,而抑制下游炎癥因子的轉(zhuǎn)錄。第五部分Bortezomib通過MAPK/AP-1信號(hào)通路對(duì)人牙周膜細(xì)胞炎癥反應(yīng)抑制作用目的:本實(shí)驗(yàn)通過研究在LPS刺激下,bortezomib對(duì)h PDLCs中MAPK信號(hào)通路的影響,及MAPK磷酸酶1(MKP1)和下游重要轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-1(AP-1)活性的影響,進(jìn)一步探討bortezomib的抗炎機(jī)制。方法:(1)Bortezomib(0.25 n M、0.5 n M和1 n M)預(yù)處理細(xì)胞6 h,與1μg/ml LPS繼續(xù)共同干預(yù)細(xì)胞0.5 h和1 h,western blot檢測(cè)MAPKs(p38、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2)、Jun氨基末端激酶(JNK)和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶5(ERK5))蛋白表達(dá)和磷酸化水平;(2)Bortezomib(0.25 n M、0.5 n M和1 n M)預(yù)處理細(xì)胞6 h,與1μg/ml LPS繼續(xù)共同干預(yù)細(xì)胞0.5 h,western blot檢測(cè)MKP1蛋白表達(dá)水平,RT-PCR檢測(cè)MKP1基因表達(dá)水平;Western blot檢測(cè)AP-1(c-Jun和c-fos)蛋白表達(dá)及磷酸化水平;免疫熒光檢測(cè)pc-Jun和pc-fos核內(nèi)表達(dá)水平。結(jié)果:(1)1μg/ml LPS促進(jìn)h PDLCs中p38、JNK、ERK1/2和ERK5磷酸化水平的上調(diào),但bortezomib選擇性的抑制p38和ERK5的磷酸化,而對(duì)JNK和ERK1/2的磷酸化無抑制作用。(2)1μg/ml LPS促進(jìn)h PDLCs中MKP1的蛋白和基因表達(dá)水平的輕微上調(diào),隨著bortezomib濃度的增加,這種上調(diào)趨勢(shì)明顯加強(qiáng)。(3)1μg/ml LPS促進(jìn)h PDLCs中c-Jun磷酸化水平的明顯上調(diào),c-fos磷酸化水平的輕度上調(diào)。而Bortezomib抑制c-Jun和c-fos的磷酸化,其中對(duì)c-Jun的抑制作用較強(qiáng)。(4)免疫熒光檢測(cè)結(jié)果與western blot結(jié)果具有一致性,1μg/ml LPS能夠促進(jìn)pc-Jun和pc-fos的核內(nèi)表達(dá),而brtezomib明顯抑制這一反應(yīng)。結(jié)論:(1)bortezomib通過抑制MKP1的降解和促進(jìn)MKP1的表達(dá),抑制MAPKs信號(hào)通路蛋白的活化,進(jìn)一步抑制AP-1的活性,而干預(yù)牙周炎癥反應(yīng)。(2)結(jié)果提示p38、ERK5和c-Jun是bortezomib的抗炎作用靶點(diǎn)。第六部分動(dòng)物實(shí)驗(yàn)--Bortezomib抑制LPS聯(lián)合結(jié)扎術(shù)誘導(dǎo)的牙周炎癥反應(yīng)目的:通過研究bortezomib對(duì)大鼠牙周炎進(jìn)展的影響,探討bortezomib的體內(nèi)抗炎作用,進(jìn)一步為bortezomib治療牙周疾病的科研成果轉(zhuǎn)化提供有力依據(jù)。方法:(1)大鼠上頜雙側(cè)第二磨牙牙周局部注射LPS,聯(lián)合結(jié)扎術(shù)構(gòu)建大鼠牙周炎模型,注射LPS之前1 h,牙周局部注射bortezomib(0.01 mg/ml、0.1 mg/ml和1 mg/ml)進(jìn)行干預(yù),隔兩天注射和干預(yù)一次,持續(xù)4 w。(2)微型計(jì)算機(jī)斷層成像(Micro-CT)掃描樣本,進(jìn)行牙槽骨吸收的線性分析和骨容量分析。(3)樣本脫鈣,制作組織切片,進(jìn)行HE染色,免疫組化檢測(cè)核因子-κB受體活化因子配體(RANKL)、骨保護(hù)素(OPG)、TNF-a、IL-1β、IL-6和IL-8的表達(dá)。結(jié)果:(1)牙周局部注射LPS聯(lián)合牙頸部結(jié)扎4 w成功構(gòu)建大鼠牙周炎模型,牙槽骨吸收明顯,達(dá)根中下份,根分叉暴露,釉牙骨質(zhì)界(CEJ)到牙槽嵴頂(ABC)之間的距離明顯高于正常組,感興趣區(qū)域(ROI)的牙周骨體積占總體積分?jǐn)?shù)比值(BV/TV值)和骨密度值明顯低于正常組。Bortezomib干預(yù)可以明顯抑制牙槽骨的吸收,減少CEJ到ABC之間的距離,增加BV/TV值和骨密度值。(2)HE染色顯示:bortezomib抑制牙周組織炎癥細(xì)胞的浸潤。(3)Bortezomib抑制牙周組織中RANKL的過表達(dá),同時(shí)促進(jìn)OPG的表達(dá)。(4)LPS聯(lián)合結(jié)扎術(shù)可誘導(dǎo)牙周組織中TNF-a、IL-1β、IL-6和IL-8的過表達(dá);而bortezomib抑制牙周組織中炎癥因子的表達(dá)。結(jié)論:局部使用bortezomib可以抑制牙周炎癥組織中TNF-a、IL-1β、IL-6和IL-8的高表達(dá)和減小RANKL/OPG的比值,抑制牙槽骨的破壞吸收。Bortezomib對(duì)牙周病的治療表現(xiàn)出潛在的藥物作用,合適劑型和劑量還有待進(jìn)一步研究。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R781.4

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