本文關(guān)鍵詞：健脾益肺Ⅱ號(hào)對(duì)COPD大鼠骨骼肌萎縮作用機(jī)制研究　出處：《廣州中醫(yī)藥大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：目的:1.觀察不同時(shí)間香煙煙霧對(duì)大鼠肺及骨骼肌的影響。2.探討中藥復(fù)方"健脾益肺Ⅱ號(hào)"對(duì)香煙煙霧誘導(dǎo)的COPD大鼠骨骼肌萎縮的作用。以及中藥復(fù)方"健脾益肺Ⅱ號(hào)(JY-Ⅱ)"通過干預(yù)AMPK/ULK-1信號(hào)通路改善COPD大鼠骨骼肌萎縮的機(jī)制。3.通過體外實(shí)驗(yàn),初步探討"健脾益肺Ⅱ號(hào)"改善骨骼肌萎縮的分子作用機(jī)制。方法:1.96只SD大鼠,采用隨機(jī)對(duì)照實(shí)驗(yàn)方法,將大鼠按體重大小排列后,根據(jù)照隨機(jī)數(shù)字表法分為6組,每組16只。分別為1個(gè)月正常組(Con-1m)、1個(gè)月模型組(CS-1m)、3個(gè)月正常組(Con-3m)、3個(gè)月模型組(CS-3m)、6個(gè)月正常組(Con-6m)、6個(gè)月模型組(CS-6m)。通過不同時(shí)間香煙煙霧刺激建立COPD大鼠模型。通過觀察大鼠一般情況、體重及飲水量變化、肺功能及肺組織病理變化、支氣管灌洗液中蛋白含量及超氧化物歧化酶含量、血常規(guī)變化及骨骼肌組織病理及其超微結(jié)構(gòu)改變?cè)u(píng)估模型建立的情況。通過檢測(cè)大鼠骨骼肌自噬相關(guān)蛋白和基因表達(dá)水平觀察香煙對(duì)大鼠骨骼肌的影響。2.將45只SD大鼠,按照隨機(jī)數(shù)字表法分為3組,每組15只。分別為正常組(Con組)、模型組(CS組)以及健脾益肺-Ⅱ號(hào)中藥組(JY-Ⅱ組)。除Con組外,CS組與JY-Ⅱ組采用香煙煙霧刺激建立COPD大鼠模型。6個(gè)月后,觀察JY-Ⅱ?qū)ο銦煙熿F刺激后大鼠一般情況、體重、飲水量、肺功能、肺組織病理、支氣管灌洗液中蛋白和氧化應(yīng)激指標(biāo)、血常規(guī)變化及骨骼肌自噬相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)情況的影響。3.體外實(shí)驗(yàn)選用大鼠成肌細(xì)胞(L6細(xì)胞系),分別用香煙煙霧提取物(CSE)和JY-Ⅱ復(fù)方干預(yù)L6細(xì)胞,觀察CSE誘導(dǎo)的L6細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白Lc3B、Beclin-1、AMPKα、p-AMPKα、ULK等表達(dá)的影響以及JY-Ⅱ干預(yù)后上述蛋白的變化。并應(yīng)用AMPK激動(dòng)劑(AICAR)和抑制劑(BML275)作用于細(xì)胞,觀察其對(duì)上述蛋白的變化。結(jié)果:1.隨著香煙煙霧刺激時(shí)間增加,CS組大鼠精神狀態(tài)逐漸變差,皮毛逐漸變黃色,干枯粗糙。飲食逐漸減少。接受香煙煙霧刺激時(shí)聚集成堆,蜷縮少動(dòng)。CS組大鼠體重增長慢于Con組(P0.05),隨熏煙時(shí)間越長,體重差異一直存在(P0.05)。香煙煙霧刺激后,CS組大鼠飲水增多,與Con組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。CS組大鼠肺總量高于Con組大鼠(P0.05)。且隨著香煙煙霧刺激天數(shù)的增加肺總量越高。在香煙煙霧刺激后第1個(gè)月和第3個(gè)月,CS組大鼠肺氣道阻力(RI)高于Con組(P0.05)。香煙煙霧刺激后第3個(gè)月,CS組大鼠FEV0.1/FVC降低,與Con組大鼠比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。光鏡下CS組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)逐漸改變,肺泡壁斷裂,融合形成肺大泡,肺泡間隔及肺泡壁增厚。從第3個(gè)月開始,CS組大鼠肺泡空白面積較Con組增多(P0.05)。香煙煙霧刺激3個(gè)月后,Con組大鼠腓腸肌肌肉組織結(jié)構(gòu)正常,CS組肌纖維散在分布,肌纖維面積較正常組減少(P0.05)。隨香煙煙霧刺激時(shí)間增加,CS組大鼠肌肉纖維面積逐漸縮小(P0.05)。在香煙煙霧刺激3個(gè)月后,電鏡下CS組肌纖維排列較整齊,嵴部皺褶少。高倍鏡下可見少量空泡樣病變。隨香煙煙霧刺激時(shí)間增加,空泡樣變逐漸增多。3個(gè)月時(shí),CS組大鼠血液中白細(xì)胞(WBC)總數(shù)、單核細(xì)胞(MONO)總數(shù)、紅細(xì)胞(RBC)總數(shù)以及血紅蛋白(HGB)含量高于Con組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);6個(gè)月時(shí)CS組紅細(xì)胞數(shù)量(RBC)以及血紅蛋白數(shù)量(HGB)高于Con組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。香煙煙霧刺激后,CS組大鼠支氣管灌洗液(BALF)蛋白高于Con組大鼠(P0.05)。而CS組SOD含量?jī)H在熏煙第1個(gè)月與Con組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),血清LDH僅在熏煙第6個(gè)月與Con組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。香煙煙霧刺激后,CS組大鼠骨骼肌自噬相關(guān)蛋白Beclin-1與LC3B(尤其是LC3B-Ⅱ)、p-AMPK與ULK-1含量升高(P0.05)。香煙煙霧刺激后,CS組大鼠腓腸肌Lc3B mRNA的相對(duì)表達(dá)高于Con組(P0.05)。2.熏煙6個(gè)月之后,JY-Ⅱ組大鼠體重高于CS組(P0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。JY-Ⅱ組大鼠且肺泡空白面積較CS組降低(P0.05)。JY-Ⅱ組大鼠腓腸肌肌肉纖維面積較CS組縮小緩慢,散在聚集的數(shù)量也減少(P0.05)。電鏡超微結(jié)構(gòu)顯示JY-Ⅱ組大鼠低倍鏡下肌纖維排列較整齊,Z線清楚,嵴部皺褶消失。高倍鏡下空泡樣變少于CS組。JY-Ⅱ組大鼠血液RBC與HGB以及血清LDH含量較CS組降低(P0.05)。JY-Ⅱ大鼠腓腸肌自噬蛋白Lc3B及Lc3B mRNA的相對(duì)表達(dá)量較CS組大鼠降低(P0.05)。3.大鼠成肌細(xì)胞(L6細(xì)胞系)經(jīng)過不同濃度的香煙煙霧提取物(CSE)干預(yù)24h、48h和72h后,呈現(xiàn)出不同的趨勢(shì)。其中10%CSE在24h對(duì)L6細(xì)胞有抑制作用(P0.05)。L6細(xì)胞經(jīng)過不同濃度的JY-Ⅱ中藥復(fù)方24h、48h和72h的干預(yù)后,呈現(xiàn)出不同的趨勢(shì)。其中在6-10mg/ml的JY-Ⅱ中藥液對(duì)L6細(xì)胞有抑制作用;且隨著時(shí)間的增加,抑制率也不斷增加,呈時(shí)間和劑量的依賴性。1-4mg/ml對(duì)L6細(xì)胞有增殖作用。不同濃度CSE均可以提高L6細(xì)胞Lc3B蛋白尤其是Lc3B-Ⅱ表達(dá)(P0.05)。在CSE誘導(dǎo)L6細(xì)胞后,自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、p-AMPK以及其下游蛋白(ULK-1)相對(duì)含量高于Con組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。JY-Ⅱ組p-AMPK及ULK-1蛋白較CS組明顯降低。結(jié)論:1.香煙煙霧能夠引起SD大鼠COPD肺部及骨骼肌病理改變。2.COPD大鼠存在骨骼肌萎縮,與香煙煙霧激活大鼠自噬蛋白上調(diào)有關(guān)。3.CSE對(duì)L6細(xì)胞的增殖作用有抑制性,且呈濃度依賴關(guān)系,濃度越高,抑制性越強(qiáng)。4.CSE能夠激活并上調(diào)L6細(xì)胞自噬蛋白的表達(dá)。5.JY-Ⅱ能夠改善COPD大鼠骨骼肌萎縮,可能是通過下調(diào)AMPK/ULK信號(hào)通路,并一定程度上抑制Lc3B表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。
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本文編號(hào)：1433282