本文關(guān)鍵詞：TET2基因轉(zhuǎn)染對急性髓系白血病細(xì)胞生長及17-DMAG治療敏感性的影響及機制　出處：《安徽醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：本研究通過三部分研究了TET2基因轉(zhuǎn)染對急性髓系白血病細(xì)胞生長及17-DMAG治療敏感性的影響及機制。第一部分我們通過回顧性分析184例急性髓系白血病患者標(biāo)本TET2突變情況,并研究患者的臨床特征、化療敏感度、生存時間等,從而為AML預(yù)后分層提供一定的參考意義。第二部分通過體外培養(yǎng)人白血病細(xì)胞HL-60,檢測17-DMAG對人白血病細(xì)胞增殖及凋亡的影響以及可能的機制。第三部分我們使用17-DMAG作用于TET2基因轉(zhuǎn)載的HL-60細(xì)胞,從而明確17-DMAG與TET2在急性白血病發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)系及機制第一部分探討TET2基因和TET2基因突變在急性髓系白血病中的表達及其臨床意義目的:分析初診急性髓系白血病TET2基因突變發(fā)生率,評價TET2突變型及TET2野生型患者臨床特征、近期療效及遠(yuǎn)期預(yù)后。方法:回顧性分析184例初治急性髓系白血病患者采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測TET2基因表達及突變,并通過直接測序的方法檢測TET2與NPM1、DNMT3a、FLT3-ITD、CEBPA的突變狀態(tài),同時收集患者臨床資料。誘導(dǎo)治療主要采用標(biāo)準(zhǔn)劑量的DA、IA或地西他濱+CAG方案。比較TET2基因突變和TET2野生型患者之間臨床資料的異同,評價TET2突變患者化療療效,及分析該基因突變表達水平與野生型患者之間的總生存率和無事件生存率的關(guān)系。結(jié)果:184例初發(fā)急性髓細(xì)胞白血病患者(非M3)標(biāo)本中檢測出32例發(fā)生TET2基因突變,發(fā)生率為17.39%;32例TET2基因突變患者組中男26例,女6例,中位年齡44歲(18 68歲);152例陰性患者組中男110例,女42例,中位年齡38.5歲(18~87歲)。兩組年齡及性別無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。與TET2野生型患者相比,TET2突變患者具有以下臨床特征:初診時患者類型多為M4、M5亞型,外周血血小板較低(P=0.04);易合并DNMT3a、FLT3-ITD、CEBPA突變,(P0.05)。但在FAB亞型,外周血白血病,血紅蛋白、骨髓原始細(xì)胞百分比、伴NPM1基因突變、NCCN預(yù)后危險分組方面,兩組無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。TET2野生型152例AML患者治療完全緩解86例(86/152,56.58%),部分緩解9例(9/152,5.92%),未緩解48例(48/152,31.58%);TET2突變組32例AML患者治療完全緩解20例(20/32,62.5%),部分緩解4例(4/32,12.5%),未緩解8例(8/32,25%);三組差別均無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.37)。184例患者隨訪12-60個月,中位隨訪時間30個月。TET2突變組患者無病生存期(DFS)和總生存期(OS)明顯短于TET2野生型組,統(tǒng)計學(xué)有明顯差異(P0.05)結(jié)論:TET2基因在中國AML患者中的突變率與西方人群相似,TET2基因突變與AML特定生物學(xué)特征相關(guān),突變患者其整體生存期及無病生存期明顯縮短,提示該突變對成人患者的危險分級和治療具有重要的意義。第二部分17-DMAG抑制白血病細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡目的:觀察17-DMAG對白血病細(xì)胞增殖及凋亡的影響方法:1.使用MTT法及細(xì)胞克隆形成實驗檢測不同濃度、不同作用時間17-DMAG對白血病細(xì)胞增殖的影響。2.使用Annexin V/PI染色及合并流式細(xì)胞術(shù)檢測不同濃度17-DMAG誘導(dǎo)白血病細(xì)胞株HL-60細(xì)胞48小時后細(xì)胞凋亡的情況。3.使用JC-1染色流式法檢測17-DMAG對HL-60細(xì)胞線粒體膜電位的影響。4.使用Western blot檢測17-DMAG作用白血病細(xì)胞HL-60后caspase-3、caspase-9、Bcl、Bax的表達,并與對照組比較,從而研究17-DMAG誘導(dǎo)白血病細(xì)胞HL-60凋亡的機制。結(jié)果:1.細(xì)胞克隆形成實驗檢測顯示17-DMAG對于白血病細(xì)胞株HL-60生長具有抑制作用,MTT法顯示17-DMAG抑制白血病細(xì)胞株HL-60細(xì)胞增殖呈時間和劑量依賴性。2.Annexin V/PI染色合并流式細(xì)胞術(shù)檢測17-DMAG誘導(dǎo)白血病細(xì)胞株HL-60細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示:17-DMAG呈時間和劑量依賴的誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞調(diào)亡。3.17-DMAG處理HL-60細(xì)胞48 h后隨著17-DMAG濃度的增加紅色熒光逐漸減弱,綠色熒光逐漸加強,JC-1染色結(jié)果表明17-DMAG可降低白血病細(xì)胞HL-60線粒體膜電位。4.17-DMAG處理48 h,促凋亡Bax,c-caspase-3和c-caspase-9的蛋白表達水平顯著高于對照組(P0.05)上調(diào),抗凋亡的存活蛋白survivin和Bcl-2的蛋白表達水平顯著(P0.01)下調(diào)。結(jié)論:逡1.17-DMAG能夠抑制HL-60細(xì)胞的增殖,隨著藥物濃度的增加、作用時間的延長,細(xì)胞生長抑制率有逐漸增加的趨勢,證實對細(xì)胞的增殖抑制作用呈時間、劑量依賴性。2.17-DMAG能夠誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡。3.17-DMAG誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡的機制,可能是通過凋亡線粒體途徑作用,與增加caspase-9和caspase-3蛋白表達,下調(diào)Bcl-2和上調(diào)Bax蛋白表達水平有關(guān)。第三部分TET2基因能增強17-DMAG對人急性髓系白血病HL-60細(xì)胞株凋亡及對信號通路PI3k/AKT信號通路影響研究目的:研究轉(zhuǎn)染TET2基因過表達對于急性急性髓系白血病HL-60細(xì)胞株增殖及凋亡的影響。探討TET2基因聯(lián)合17-DMAG對人白血病細(xì)胞HL-60細(xì)胞增殖及凋亡的作用及對信號通路PI3K/AKT影響,進而為急性髓系白血病白血病的治療探索新思路。方法:1.將過表達TET2慢病毒載體pWPT-PURO-TET2轉(zhuǎn)染至白血病HL-60細(xì)胞株,以提高白血病HL-60細(xì)胞系TET2的表達。為了分析重組慢病毒載體是否成功的轉(zhuǎn)染HL-60細(xì)胞,在感染后第3天通過熒光顯微鏡觀察是否有GFP+的HL-60細(xì)胞及陽性細(xì)胞的比例,并用Western blot法檢測TET2蛋白的表達情況。2.通過MTT法檢測白血病細(xì)胞HL-60轉(zhuǎn)染TET2前后細(xì)胞生長曲線變化。3.使用Annexin V/PI雙染的方法通過流式細(xì)胞儀測定轉(zhuǎn)染前后白血病細(xì)胞的凋亡情況。4.MTT法檢測17-DMAG藥物作用于TET2轉(zhuǎn)染后白血病細(xì)胞株HL-60細(xì)胞增殖及抑制的作用。5.使用Annexin V/PI染色合并流式細(xì)胞術(shù)檢測TET2過表達增強白血病HL-60細(xì)胞對17-DMAG的治療敏感性。6.使用western blot方法檢測17-DMAG對TET2轉(zhuǎn)染后白血病細(xì)胞株HL-60PI3K/Akt信號通路的影響。結(jié)果:1.熒光顯微鏡檢查顯示慢病毒pWPT-PURO-GFP-TET2轉(zhuǎn)染的人白血病HL-60細(xì)胞系,超過80%的細(xì)胞是GFP+。Western blot法檢測TET2蛋白的表達情況,檢測結(jié)果示,轉(zhuǎn)染過表達TET2質(zhì)粒的白血病HL-60細(xì)胞系TET2蛋白表達遠(yuǎn)大于空載體轉(zhuǎn)染組。2.MTT法結(jié)果表明轉(zhuǎn)染組較轉(zhuǎn)染空載體組細(xì)胞生長明顯減慢(P0.05)。3.使用Annexin V/PI雙染的方法通過流式細(xì)胞儀測定白血病細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染過表達TET2載體的白血病HL-60細(xì)胞系凋亡明顯增加(P0.05)。4.17-DMAG作用于轉(zhuǎn)染過表達TET2載體的白血病HL-60細(xì)胞后,MTT法結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染TET2基因,或是加入1.6μmol·L17-DMAG,都能夠明顯抑制HL-60細(xì)胞增殖率,尤以轉(zhuǎn)染TET2聯(lián)合17-DMAG對細(xì)胞增殖的抑制作用最強(P0.05)。5.Western blot檢測表明17-DMAG作用于轉(zhuǎn)染過表達TET2的HL-60細(xì)胞后,TET2蛋白在白血病細(xì)胞HL-60中表達明顯增強,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。6.流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示TET2基因過表達可以增強17-DMAG誘導(dǎo)白血病HL-60細(xì)胞凋亡。7.17-DMAG通過抑制PI-3K/Akt信號通路促進HL-60白血病細(xì)胞凋亡,主要是通過信號通路中Bax、caspase-3、caspase-3表達增強,Bcl-2、survivin表達下降實現(xiàn)的。結(jié)論:1.TET2過表達可以引起白血病細(xì)胞HL-60生長減慢,凋亡增多,可能為白血病的一種抑癌基因。2.TET2能協(xié)同17-DMAG促進HL-60細(xì)胞的凋亡,抑制細(xì)胞的增殖。3.TET2協(xié)同17-DMAG對HL-60細(xì)胞的生長的影響是通過PI3k/AKT信號通路實現(xiàn)的。
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本文編號：1432742