發(fā)布時(shí)間：2018-01-16 02:09

  本文關(guān)鍵詞：阿法替尼聯(lián)合利尿酸治療非小細(xì)胞肺癌突變耐藥細(xì)胞株的效果和機(jī)制研究　出處：《廣西醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：背景與目的:眾周所知,肺癌是中國(guó)乃至世界的頭號(hào)癌癥殺手,且發(fā)病率持續(xù)增加,雖然根據(jù)肺癌的病理特征分為非小細(xì)胞肺癌和小細(xì)胞肺癌兩類,但據(jù)流行病調(diào)查發(fā)現(xiàn),非小細(xì)胞肺癌(non small-cell lung cancer,NSCLC)占80%~85%。約70%-80%的患者在確診時(shí)已屬中晚期,因此,對(duì)大部分肺癌患者而言,非手術(shù)治療方式具有重要的作用。目前細(xì)胞毒藥物化療對(duì)此類人群是有效的治療選擇,但患者總生存期(overall survival,OS)也僅有12個(gè)月左右,患者3年及5年生存率分別僅為19%和11%。目前針對(duì)晚期非小細(xì)胞肺癌的治療以放化療和靶向治療為主,但各方案的有效率僅在20%~30%。而可逆性抑制表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)的酪氨酸激酶抑制劑(TKI)靶向治療藥物,在用藥10個(gè)月左右后會(huì)出現(xiàn)耐藥甚至病情惡化。而對(duì)所有Erb B受體家族進(jìn)行不可逆地抑制的第二代TKI藥物阿法替尼(afatinib),雖然對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)的阻斷更全面、更持久,但也不可避免的產(chǎn)生耐藥,加上沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān),如何開發(fā)出更經(jīng)濟(jì)有效的治療模式是當(dāng)前醫(yī)學(xué)研究急需解決的問題之一。利尿酸(Ethacrynic acid,EA)是一種親電子髓袢利尿劑,是第一個(gè)被用作抗腫瘤藥物研究的谷胱苷肽轉(zhuǎn)移酶S(Glutathion S-transferases,GSTs)抑制劑,可直接作用于GSTs的底物以阻斷其發(fā)揮作用,或與谷胱甘肽(Glutathione,GSH)硫醇基發(fā)生Michael加成反應(yīng)以清除體內(nèi)GSH,從而抑制GSTs活性,增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的敏感性。近年研究發(fā)現(xiàn)EA及其衍生物除了具有利尿作用外,高濃度條件下還可作為GST和WNT的抑制劑,在乳腺癌中發(fā)揮一定的抗腫瘤作用。近期研究還發(fā)現(xiàn)降低GSH在體內(nèi)的合成可以逆轉(zhuǎn)不可逆TKI afatinib的耐藥治療。而關(guān)于afatinib聯(lián)合EA在肺癌中的用藥研究至今尚未見報(bào)道,因此我們擬進(jìn)行afatinib聯(lián)合EA治療突變型非小細(xì)胞肺癌的研究,一方面分析其聯(lián)合用藥效果,另一方面探討其可能的功能機(jī)制,為臨床治療過程中非小細(xì)胞肺癌的聯(lián)合用藥提供理論基礎(chǔ)和試驗(yàn)依據(jù)。材料與方法:體外實(shí)驗(yàn):對(duì)人NSCLC原發(fā)性耐藥細(xì)胞株A549和繼發(fā)性耐藥細(xì)胞株H1975應(yīng)用EGFR-TKI afatinib和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶抑制劑EA單用和聯(lián)合應(yīng)用進(jìn)行研究。應(yīng)用CCK8法檢測(cè)afatinib和EA單藥對(duì)細(xì)胞的殺傷作用,計(jì)算各單藥的IC50,同時(shí)檢測(cè)聯(lián)合用藥的協(xié)同效應(yīng);應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)afatinib和EA單藥和聯(lián)合用藥對(duì)A549、H1975細(xì)胞的周期、凋亡的影響;應(yīng)用Transwell法檢測(cè)單藥和聯(lián)合用藥后A549、H1975細(xì)胞的侵襲、遷移能力的變化;以繼發(fā)性耐藥的H1975為研究對(duì)象,Blank組、afatinib組、EA組及聯(lián)合用藥組作用24h后,進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序并分析,通過對(duì)基因的表達(dá)差異分析,篩選出發(fā)揮作用的基因,利用RT-PCR檢測(cè)篩選出的基因的相對(duì)表達(dá)量。體內(nèi)實(shí)驗(yàn):將接種了A549、H1975移植瘤的裸鼠模型隨機(jī)分為兩組,即A549組、H1975組,每組再隨機(jī)分為4組,(1)Blank組:PBS組;(2)afatinib組:afatinib 25mg/kg/d;(3)EA組:EA 20mg/kg/d;(4)afatinib+EA組:afatinib 25mg/kg/d+EA 20mg/kg/d,灌胃給藥,每7天一個(gè)周期,共三個(gè)周期,每周兩次測(cè)量腫瘤體積大小,繪制腫瘤的生長(zhǎng)曲線,21天后取瘤稱取裸鼠體重,了解聯(lián)合用藥治療對(duì)裸鼠移植瘤的抑制作用。結(jié)果:1.1 Afatinib、EA對(duì)A549、H1975細(xì)胞的殺傷作用分別用afatinib、EA單藥和聯(lián)合用藥處理A549、H1975細(xì)胞48h后,觀察到單藥組及聯(lián)合用藥組具有不同的殺傷細(xì)胞的效果。隨著藥物濃度的遞增,各處理組殺傷細(xì)胞的效果逐漸增強(qiáng),其中,聯(lián)合用藥組明顯強(qiáng)于各單藥組,協(xié)同增效作用明顯。One-way ANOVA檢驗(yàn)分析結(jié)果顯示,聯(lián)合用藥組對(duì)細(xì)胞的殺傷效應(yīng)優(yōu)于afatinib單藥組,并呈現(xiàn)劑量依賴的抗增殖效應(yīng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。采用Bio Calcusyn軟件計(jì)算聯(lián)合用藥的CI值,發(fā)現(xiàn)隨著藥物濃度的增高,殺傷效果逐漸增強(qiáng),尤其對(duì)于繼發(fā)性耐藥的H1975細(xì)胞表現(xiàn)出強(qiáng)烈的協(xié)同效應(yīng)(CI0.3)。1.2 Afatinib聯(lián)合EA能抑制A549、H1975細(xì)胞的體外、體內(nèi)增殖采用CCK8法檢測(cè)相同濃度條件下對(duì)A549、H1975細(xì)胞殺傷的影響。結(jié)果顯示聯(lián)合用藥組處理后的細(xì)胞殺傷率均明顯高于同濃度下afatinib組、EA組,對(duì)H1975殺傷的影響較A549尤為明顯。通過測(cè)量各組裸鼠移植瘤體積,單藥組、聯(lián)合用藥組平均瘤體積均低于Blank組。A549組中Blank組、afatinib組、EA組、聯(lián)合用藥組腫瘤平均體積分別為1554.7±340.22mm3、604.6±87.80mm3、1093.5±144.53mm3、402.8±89.61mm3;H1975組中Blank組、afatinib組、EA組、聯(lián)合用藥組腫瘤平均體積分別為870.7±126.23mm3、484.1±76.65mm3、723.3±135.72mm3、82.9±24.71mm3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示聯(lián)合用藥組瘤體積明顯小于Blank組及各單藥組,與afatinib組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。A549組中Blank組、afatinib組、EA組、聯(lián)合用藥組抑瘤率分別為0%、51.75±9.17%、29.25±10.37%、69.76±4.25%(F=18.345,p0.05);H1975組中Blank組、afatinib組、EA組、聯(lián)合用藥組抑瘤率分別為0%、48.72±10.02%、23.54±12.76%、84.12±8.27%(F=50.192,p0.05)。其中,聯(lián)合用藥組抑瘤率最高,說明聯(lián)合用藥對(duì)抑制移植瘤的生長(zhǎng)具有協(xié)同作用,與細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。1.3 Afatinib聯(lián)合EA對(duì)A549、H1975細(xì)胞周期、凋亡的影響CCK8法實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示聯(lián)合用藥組較各單藥組能夠明顯協(xié)同抑制腫瘤細(xì)胞的增殖,這種對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響可能與細(xì)胞周期、凋亡及其機(jī)制有關(guān),因此我們應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)單藥和聯(lián)合用藥對(duì)腫瘤細(xì)胞周期、凋亡的影響。細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果顯示:對(duì)于A549細(xì)胞,聯(lián)合用藥組與Blank組、各單藥組比較,G0/G1期細(xì)胞的比例明顯增加(p0.05);對(duì)于H1975細(xì)胞,聯(lián)合用藥組S+G2期細(xì)胞的比例明顯增加(p0.05)。細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示:單藥組處理A549、H1975細(xì)胞48h后均可促使其凋亡,凋亡率分別為2.5%、2.9%、11.3%、4.7%。聯(lián)合用藥組細(xì)胞凋亡均有所增加,分別為5.7%、41.8%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),提示afatinib聯(lián)合EA可顯著協(xié)同誘導(dǎo)H1975細(xì)胞的凋亡。1.4 Afatinib聯(lián)合EA對(duì)A549、H1975細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響Transwell法實(shí)驗(yàn)觀察對(duì)A549、H1975細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響。結(jié)果顯示:各單藥組、聯(lián)合用藥組穿過濾膜進(jìn)入下室的細(xì)胞數(shù)較Blank組均減少,聯(lián)合用藥組較各單藥組穿過濾膜進(jìn)入下室的細(xì)胞數(shù)均減少,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05);在侵襲實(shí)驗(yàn)中,A549細(xì)胞afatinib組、H1975細(xì)胞各單藥組、聯(lián)合用藥組細(xì)胞分解細(xì)胞外基質(zhì)穿過濾膜進(jìn)入下室細(xì)胞減少,聯(lián)合用藥組較各單藥組進(jìn)入下室的細(xì)胞數(shù)均減少,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05);而A549細(xì)胞EA組較Blank組進(jìn)入下室細(xì)胞數(shù)未見明顯減少,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。1.5 Afatinib聯(lián)合EA對(duì)H1975細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)檢測(cè)及機(jī)制研究轉(zhuǎn)錄組學(xué)(Transcriptomics)是一門研究細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄情況和轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律的學(xué)科,通過在RNA水平上對(duì)基因的表達(dá)進(jìn)行研究。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA sequencing)對(duì)基因功能和基因結(jié)構(gòu)整體水平的研究,可以揭示藥物靶點(diǎn)生物學(xué)過程。本研究中以繼發(fā)性耐藥的H1975細(xì)胞為對(duì)象,Blank組、各單藥組及聯(lián)合用藥組作用24h后,提取RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,通過對(duì)文獻(xiàn)的參考及對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中基因表達(dá)差異分析,我們找出EGFR、P53、TNFSF14、VEGFA、WNT5A、WNT10A、MAPKAP1及MAPK8IP3等相關(guān)基因,利用RT-PCR檢測(cè)篩選出的基因的相對(duì)表達(dá)量,結(jié)果與測(cè)序結(jié)果基本一致,表明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果是可靠的。通過對(duì)差異表達(dá)的基因分析我們找出發(fā)現(xiàn)主要與20條信號(hào)通路相關(guān),其中,與癌癥最密切的是Pathway in cancer、Wnt signaling pathway和cytokine-cytokine receptor interaction這三條信號(hào)通路。根據(jù)基因表達(dá)差異數(shù)據(jù)分析我們發(fā)現(xiàn)了155個(gè)上調(diào)和175個(gè)下調(diào)的基因。(篩選條件:FDR0.01,Log Fold-change≥2和≤-2,Pvalue0.001)。為后續(xù)進(jìn)一步研究聯(lián)合用藥對(duì)抗繼發(fā)性耐藥NSCLC的分子機(jī)制提供重要的數(shù)據(jù)資源。結(jié)論:1.Afatinib或EA單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用均對(duì)A549、H1975細(xì)胞具有殺傷作用;聯(lián)合用藥對(duì)A549細(xì)胞在較大劑量(afatinib IC50+EAIC50)時(shí)有協(xié)同殺傷效應(yīng);對(duì)H1975細(xì)胞具有強(qiáng)烈的協(xié)同殺傷作用,CI0.3。2.Afatinib聯(lián)合EA可在體外、體內(nèi)殺傷耐藥非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549、H1975,尤其對(duì)繼發(fā)性耐藥的肺癌細(xì)胞H1975殺傷效果尤為明顯。3.Afatinib和/或EA對(duì)A549、H1975細(xì)胞周期具有阻滯作用,對(duì)細(xì)胞凋亡具有協(xié)同促進(jìn)作用;對(duì)A549、H1975細(xì)胞的遷移、侵襲能力具有抑制作用。4.Afatinib聯(lián)合EA與afatinib單藥對(duì)人肺癌細(xì)胞H1975的基因表達(dá)差異,上調(diào)基因有FGFR2、TNFRSF4、WNT6、FZD6、CCR1、IL1R2等,下調(diào)基因有CBLC、SMO、IL12B、CXCL14、CX3CR1、NGFR等;可能通過Pathway in cancer、Wnt signaling pathway和cytokine-cytokine receptor interaction這三條信號(hào)通路中某些靶點(diǎn)發(fā)揮抗繼發(fā)性耐藥NSCLC細(xì)胞的作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R734.2

【參考文獻(xiàn)】

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1 徐艷敏;錢程;夏鋒;;低濃度阿霉素對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響[J];實(shí)用臨床醫(yī)藥雜志;2010年13期

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本文編號(hào)：1431067