本文關(guān)鍵詞：基于轉(zhuǎn)錄組芯片篩選的IncRNAs在嬰幼兒血管瘤中的作用及其機(jī)制研究　出處：《山東大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：第一部分:基于轉(zhuǎn)錄組芯片的嬰幼兒血管瘤組織中長鏈非編碼RNAs(lncRNAs)表達(dá)譜分析嬰幼兒血管瘤是嬰幼兒時期最常見的良性血管性腫瘤,嬰幼兒血管瘤的發(fā)病率約為3%～10%。臨床上嬰幼兒血管瘤表現(xiàn):增生期以出生后一年以內(nèi)快速增生為特征,消退期以一年以后自發(fā)消退為特征,3～5年后可進(jìn)入消退完成期。增生期嬰幼兒血管瘤是以不成熟內(nèi)皮細(xì)胞的異常增殖為特征,而消退期嬰幼兒血管瘤的內(nèi)皮細(xì)胞逐漸成熟,血管團(tuán)塊逐漸形成管腔結(jié)構(gòu),消退完成期嬰幼兒血管瘤瘤體的血管結(jié)構(gòu)逐漸由脂肪組織和纖維結(jié)締組織所取代。在增生期嬰幼兒血管瘤中,血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞成類圓形,細(xì)胞核較大,消退期血管瘤中,血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞變細(xì)長,逐漸成熟。嬰幼兒血管瘤由血管瘤干細(xì)胞,血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞,周細(xì)胞,肥大細(xì)胞等構(gòu)成。嬰幼兒血管瘤各種細(xì)胞組分的成功分離,揭示了血管瘤干細(xì)胞的存在。移植血管瘤干細(xì)胞于裸鼠體內(nèi)可以模擬嬰幼兒血管瘤的典型三期臨床表現(xiàn),這為研究嬰幼兒血管瘤的發(fā)病機(jī)制提供新的依據(jù),暗示嬰幼兒血管瘤可能來源于血管瘤干細(xì)胞,嬰幼兒血管瘤的增生與消退有可能是與血管瘤干細(xì)胞的增殖與消退有關(guān)。嬰幼兒血管瘤發(fā)病機(jī)制假說有,胎盤內(nèi)皮細(xì)胞栓塞假說,血管生成或者血管形成能力增加學(xué)說,組織缺氧學(xué)說。嬰幼兒血管瘤中重要的信號通路機(jī)制包括,VEGF/VEGFR通路,Notch通路,β腎上腺素受體通路,HIF-α信號通路,PI3K/Akt/mTOR信號通路,PDGFB/PDGFR-β信號通路。雖然關(guān)于嬰幼兒血管瘤的發(fā)病機(jī)制存在多種假說,目前嬰幼兒血管瘤發(fā)病機(jī)制不清,血管內(nèi)皮細(xì)胞異常增殖為特征的病理性血管生成是嬰幼兒血管瘤的重要病理機(jī)制。而血管生成不足通常出現(xiàn)在缺血性疾病如心梗、中風(fēng)等相關(guān)性疾病,而過度血管生成常在腫瘤增殖、炎癥反應(yīng)和視網(wǎng)膜病變等生理過程中起負(fù)面作用。故探究嬰幼兒血管瘤血管生成的相關(guān)機(jī)制,亦有利于揭示病理性血管生成相關(guān)性疾病的發(fā)病機(jī)制。長鏈非編碼RNAs(lncRNAs)是一類長度200堿基的幾乎不編碼蛋白的RNA。LncRNAs參與大量生命活動過程,如染色體印記,表觀遺傳學(xué)調(diào)控,細(xì)胞周期調(diào)控,細(xì)胞凋亡調(diào)控,多能干細(xì)胞的調(diào)控等。LncRNAs在腫瘤、心血管、神經(jīng)發(fā)育等病理生理活動中起重要調(diào)控作用。在血管生成方面,lncRNAs在生理性血管生成及病理性血管生成中起重要調(diào)控作用,例如在血管內(nèi)皮細(xì)胞中,抑制lncRNA MALAT1促進(jìn)細(xì)胞遷移同時抑制細(xì)胞增殖能力;在糖尿病相關(guān)腎臟微循環(huán)障礙,敲減LncRNA RNCR3可減輕腎臟血管功能障礙;糖尿病視網(wǎng)膜病變中,敲減lncRNA MIAT明顯減輕糖尿病誘發(fā)的微循環(huán)障礙癥狀。故lncRNAs有可能在病理性新生血管生成中起到重要調(diào)控作用。目前l(fā)ncRNA在嬰幼兒血管瘤方面的表達(dá)情況及作用機(jī)制尚不清楚,本研究擬在現(xiàn)有工作基礎(chǔ)上,對目標(biāo)長鏈非編碼RNA在嬰幼兒血管瘤發(fā)病機(jī)制之一的病理性血管生成作用方面,進(jìn)行效應(yīng)及機(jī)制的深入研究,可進(jìn)一步完善lncRNA在嬰幼兒血管瘤發(fā)生中的作用機(jī)理,也有可能為病理性血管生成相關(guān)性疾病的研究提供有力依據(jù)。研究目的:本章節(jié)擬利用lncRNA芯片技術(shù)進(jìn)行嬰幼兒血管瘤組織中l(wèi)ncRNA表達(dá)譜分析,通過生物信息學(xué)分析差異表達(dá)的LncRNA,篩選出與血管生成相關(guān)的lncRNA,采用QPCR驗證其在嬰幼兒血管瘤瘤體中的表達(dá)量,并初步探討其功能,為嬰幼兒血管瘤的病理機(jī)制的研究提供新的突破點。研究方法:收集2013年6月份到2016年6月份山東省立醫(yī)院燒傷整形外科就診的增生期嬰幼兒血管瘤及瘤體旁組織的標(biāo)本,存放于液氮中。采用Trizol一步法提取RNA,應(yīng)用基因芯片技術(shù)進(jìn)行嬰幼兒血管瘤瘤體對比瘤體旁正常組織進(jìn)行l(wèi)ncRNA及mRNA表達(dá)譜分析。芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行差異表達(dá)基因的生物信息學(xué)分析,并結(jié)合文獻(xiàn),選擇目的分子。采用熒光定量PCR檢測目標(biāo)lncRNA表達(dá)量,驗證目標(biāo)lncRNA是否差異性表達(dá),并判斷差異表達(dá)倍率是否與芯片分析結(jié)果一致。結(jié)果:增生期嬰幼兒血管瘤lncRNA+mRNA表達(dá)譜芯片分析數(shù)據(jù)經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化分析處理,選擇變化倍率超過2倍,p0.05,為差異表達(dá)lncRNA和mRNA。相對于增生期嬰幼兒血管瘤體旁正常組織,嬰幼兒血管瘤瘤體,有1259個lncRNA高表達(dá),857個lncRNA低表達(dá),另外有1469個mRNA高表達(dá),1184個mRNA低表達(dá)。這些數(shù)據(jù)資料已上傳GEO數(shù)據(jù)庫(GSE78811)。采用KOBAS 2.0系統(tǒng)分析差異表達(dá)mRNA,其中排名前30的GO條目包括大血管發(fā)育,血管調(diào)節(jié),血管發(fā)生,細(xì)胞遷移,內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)育,心血管系統(tǒng)發(fā)育,血管生成和組織遷移。排名前30的通路信息條目包括"一氧化氮激活鳥苷酸環(huán)化酶","表皮生長因子受體(EGFR)與磷脂酶C-gamma的相互聯(lián)系","血管內(nèi)皮生長因子信號通路(VEGF)","血管平滑肌收縮","神經(jīng)生長因子信號通路(NGF)","非整合膜蛋白-細(xì)胞外基質(zhì)和Rho GTPase環(huán)路相互作用"。共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)關(guān)聯(lián)分析圖展示MEG3,MEG8,FENDRR和Linc00152與之相關(guān)mRNA的關(guān)系,提示一個lncRNA有可能與幾個到數(shù)十個mRNAs相關(guān)聯(lián)。根據(jù)文獻(xiàn)及生物信息學(xué)分析,選擇目標(biāo)靶分子進(jìn)行QPCR分析,其中文獻(xiàn)推薦的分子有MALAT1,MEG3,MEG8,FENDRR,Linc00152,根據(jù)生物信息學(xué)分析選定的分子有 p29066,p33867,p44557_v4 和 p8683,選定的 mRNA 分子為 F0XF1,EGFL7。采用QPCR法在大樣本中驗證芯片結(jié)果;其中9個lncRNAs(MALATl,MEG3,MEG8,p29066,p33867,FENDRR,linc00152,p44557_v4,and p8683)和 2 個mRNAs(F0XF1,EGFL7)經(jīng)過QPCR驗證,與芯片結(jié)果一致。結(jié)論及意義:1.首次進(jìn)行增生期嬰幼兒血管瘤瘤體對比瘤體旁正常組織的lncRNA的表達(dá)譜芯片分析,結(jié)果為有1259個lncRNA高表達(dá),857個lncRNA低表達(dá),另外有1469個mRNA高表達(dá),1184個mRNA低表達(dá),提示lncRNA和mRNA分子在嬰幼兒血管瘤中存在顯著差異性表達(dá)。2.生物信息學(xué)分析顯示,排名前30的G0條目包括大血管發(fā)育,血管調(diào)節(jié),血管發(fā)生,細(xì)胞遷移,內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)育,心血管系統(tǒng)發(fā)育,血管生成和組織遷移,共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)關(guān)聯(lián)圖展示MEG3,MEG8,FENDRR和Linc00152與之相關(guān)mRNA的關(guān)系,提示差異表達(dá)的lncRNA可能與嬰幼兒血管瘤中血管生成機(jī)制存在相關(guān)性。3.差異表達(dá)的lncRNA中,我們選取文獻(xiàn)推薦的分子MALAT1,MEG3,MEG8,FENDRR,1 inc00152,根據(jù)生物信息學(xué)分析選定的分子p29066,p33867,p44557_v4 和 p8683,選定的 mRNA 分子為 F0XF1,EGFL7 為目標(biāo),分子,進(jìn)行QPCR分析,結(jié)果與芯片結(jié)果相一致。提示差異表達(dá)的lncRNA可能與嬰幼兒血管瘤的疾病發(fā)展存在相關(guān)性。第二部分:MALAT1在嬰幼兒血管瘤組織的表達(dá)及功能研究研究目的:我們前期工作發(fā)現(xiàn)嬰幼兒血管瘤瘤體lncRNA存在顯著差異表達(dá),其中明星分子MALAT1表達(dá)上調(diào)明顯。在新生血管生成中,lncRNAMIAT及MALAT1在糖尿病視網(wǎng)膜病變中促進(jìn)新生血管生成。而嬰幼兒血管瘤以病理性血管生成為特征。本試驗?zāi)康脑谟谔骄繈胗變貉芰鲋羞^表達(dá)的MALAT1是否對血管生成過程有調(diào)控作用。研究方法:首先擴(kuò)大樣本量,采用QPCR法探究MALAT1在嬰幼兒血管瘤瘤體中的表達(dá)量。再次采用shRNA慢病毒感染臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,采用MTT法探究MALAT1在細(xì)胞增殖方面的作用,采用流式細(xì)胞儀法檢測MALAT1在細(xì)胞周期調(diào)控方面的作用,檢測細(xì)胞凋亡情況,采用血管生成實驗檢測MALAT1對血管生成的調(diào)控作用。結(jié)果:擴(kuò)大樣本量后,MALAT1在增生期嬰幼兒血管瘤中依然存在高表達(dá);shRNA病毒感染法敲減MALAT1,敲減組MALAT1表達(dá)量約為對照組的41%,MTT實驗提示敲減MALAT1顯著抑制細(xì)胞增殖,流式細(xì)胞儀檢測提示敲減MALAT1顯著引起S期延長,凋亡檢測提示敲減MALAT1誘導(dǎo)凋亡,血管生成實驗提示敲減MALAT1抑制體外血管生成。結(jié)論及意義:MALAT1在增生期嬰幼兒血管瘤中存在高表達(dá),敲減MALAT1顯著抑制臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,抑制體外血管生成。故過表達(dá)的MALAT1有可能在嬰幼兒血管瘤增生期的快速增殖和快速血管生成中起重要作用。第三部分:FENDRR及F0XF1在嬰幼兒血管瘤組織中的表達(dá)及其機(jī)制研究研究目的:前期工作發(fā)現(xiàn)血管瘤瘤體lncRNA存在顯著差異表達(dá),其中FENDRR及其鄰近轉(zhuǎn)錄因子F0XF1表達(dá)上調(diào)明顯,FENDRR為表達(dá)上調(diào)倍率最高的lncRNA分子。FENDRR在胚胎時期的大血管心臟及體壁的發(fā)育中起重要調(diào)節(jié)作用,在血管內(nèi)皮細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)F0XF1促進(jìn)體外血管生成,同時F0XF1促進(jìn)胚胎時期大血管發(fā)育。嬰幼兒血管瘤以血管生成活動過度為特征,而FENDRR和F0XF1在嬰幼兒血管瘤中雖表達(dá)增高,但其作用及機(jī)制尚不清楚。故該課題旨在探究FENDRR在嬰幼兒血管瘤中的作用,及FOXF1與FENDRR之間的調(diào)控機(jī)制研究。研究方法:本課題擬擴(kuò)大樣本量采用QPCR法驗證FENDRR與F0XF1表達(dá)量;采用shRNA構(gòu)建慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后構(gòu)建FENDRR敲減細(xì)胞株,采用MTT法、流式細(xì)胞儀檢測法、血管生成實驗探究FENDRR的細(xì)胞學(xué)功能;采用熒光素酶報告基因法探究F0XF1是否調(diào)控FENDRR的表達(dá);于HUVEC中轉(zhuǎn)染慢病毒敲減FENDRR,后采用QPCR法檢測F0XF1表達(dá)量;于HUVEC中轉(zhuǎn)染過表達(dá)F0XF1慢病毒,后采用QPCR法檢測FENDRR表達(dá)量;采用表達(dá)譜芯片法探究FENDRR調(diào)控血管生成間接機(jī)制,選擇目標(biāo)蛋白,采用蛋白質(zhì)印跡法驗證芯片結(jié)果。結(jié)果:1.QPCR實驗證實,lncRNA FENDRR及轉(zhuǎn)錄因子F0XF1在增生期嬰幼兒血管瘤組織中的相對于瘤體旁正常組織存在顯著高表達(dá),且FENDRR的表達(dá)量與F0XF1的表達(dá)量之間存在正相關(guān)。2.體外功能學(xué)實驗發(fā)現(xiàn),于臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中敲減FENDRR后,可顯著抑制臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,細(xì)胞周期檢測發(fā)現(xiàn)敲減FENDRR可引起G2/M期阻滯,體外血管生成實驗發(fā)現(xiàn),敲減FENDRR可顯著抑制血管生成現(xiàn)象。3.為探究轉(zhuǎn)錄因子F0XF1是否可以轉(zhuǎn)錄激活LncRNA FENDRR,采用熒光素酶報告基因?qū)嶒?證實F0XF1可轉(zhuǎn)錄激活FENDRR;另外,在臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中過表達(dá)F0XF1,FENDRR的表達(dá)量顯著升高;在臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中敲減FENDRR后,QPCR法檢測F0XF1表達(dá)量顯著下降。提示轉(zhuǎn)錄因子F0XF1與FENDRR之間可能存在負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制。4.為探究lncRNA FENDRR的下游調(diào)節(jié)機(jī)制,采用基因表達(dá)譜芯片分析,結(jié)果為在臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中敲減FENDRR后,相對于對照組,敲減FENDRR組上調(diào)基因364,下調(diào)基因207個(表達(dá)量變化大于1.5倍,且P值要小于0.05),IPA分析提示,EIF2信號通路被顯著抑制,AMPK信號通路被顯著激活,鑒于功能學(xué)實驗提示敲減FENDRR抑制細(xì)胞增殖和血管生成,并可引起細(xì)胞周期的G2/M期阻滯,我們選取相關(guān)調(diào)節(jié)基因,如PLK1,KIAA0101和CCND2,采用Western Blot法驗證其表達(dá)量,提示敲減FENDRR可抑制PLK1,KIAA0101和CCND2表達(dá)量。結(jié)論及意義:1.增生期嬰幼兒血管瘤中,轉(zhuǎn)錄因子F0XF1及l(fā)ncRNA FENDRR顯著高表達(dá),且FENDRR與F0XF1的表達(dá)量存在正相關(guān)。2.F0XF1激活的過表達(dá)FENDRR,有可能通過激活PLK1,KIAA0101和CCND2表達(dá),起到促進(jìn)細(xì)胞增殖,促進(jìn)血管生成的效果。3.探究FENDRR與新生血管生成相關(guān)機(jī)制有可能揭開LncRNA在嬰幼兒血管瘤發(fā)病中的作用,為新生血管生成性疾病的靶向治療提供靶點。第四部分結(jié)論及創(chuàng)新點結(jié)論1.嬰幼兒血管瘤lncRNA表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)約1259個lncRNA分子上調(diào),857個lncRNA分子下調(diào),另外有1469個mRNA高表達(dá),1184個mRNA低表達(dá)。其中經(jīng)驗證9個lncRNA和2個mRNA經(jīng)過QPCR驗證表達(dá)存在明顯差異,且差異變化規(guī)律與芯片結(jié)果一致。2.LncRNAMALAT1在增生期嬰幼兒血管瘤中顯著高表達(dá)。功能學(xué)實驗中,敲減MALAT1可顯著抑制細(xì)胞增殖,抑制血管生成,誘導(dǎo)S期阻滯。3.LncRNA FENDRR在增生期嬰幼兒血管瘤中高表達(dá)。功能學(xué)實驗中,下調(diào)FENDRR可抑制細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,誘導(dǎo)G2/M期阻滯,同時抑制血管生成。4.機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)F0XF1可轉(zhuǎn)錄激活FENDRR,抑制FENDRR可通過下調(diào)PLK1,KIAA0101和CCND2的表達(dá)來產(chǎn)生抑制血管生成、抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡、引起G2/M阻滯的效應(yīng)。創(chuàng)新性:1.首次在嬰幼兒血管瘤中采用表達(dá)譜芯片法研究長鏈非編碼RNA的差異表達(dá),并應(yīng)用生物信息學(xué)分析結(jié)合文獻(xiàn)選定目標(biāo)分子,為深入研究lncRNA在嬰幼兒血管瘤的功能及其機(jī)制提供依據(jù)。LncRNAs在病理性血管生成及生理性血管生成中均起到重要的調(diào)控作用,而嬰幼兒血管瘤的病理特征為病理性血管生成,故從嬰幼兒血管瘤組織中篩選出差異表達(dá)的lncRNA分子,并探究其在病理性血管生方面的作用及其機(jī)制,有可能為其他病理性血管生成性疾病的研究提供有力依據(jù)。2.首次發(fā)現(xiàn)MALAT1在增生期嬰幼兒血管瘤中高表達(dá),MALAT1促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖,促進(jìn)血管生成。提示MALAT1具有促進(jìn)細(xì)胞增殖和血管生成的作用,MALAT1在嬰幼兒血管瘤中有可能起到促進(jìn)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管生成的作用,MALAT1有可能成為治療血管過度生成性疾病的新靶點,這為血管生成性疾病的機(jī)制研究及治療提供依據(jù)。3.首次發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子F0XF1誘導(dǎo)的過表達(dá)FENDRR通過PLK1,KIAA0101,CCND2促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖,促進(jìn)血管生成。提示FENDRR具有促進(jìn)細(xì)胞增殖和促進(jìn)血管生成的作用,FENDRR有可能參與嬰幼兒血管瘤的發(fā)病機(jī)制,并且FENDRR有可能成為治療血管生成相關(guān)性疾病的新靶點。本研究深入探討并明確目標(biāo)lncRNA FENDRR及通路中相關(guān)分子對血管瘤的調(diào)控作用,不但可以完善血管瘤的發(fā)病機(jī)制,填補(bǔ)相關(guān)領(lǐng)域的空白,而且可以從分子生物學(xué)角度為嬰幼兒血管瘤的疾病干預(yù)提供理論依據(jù)。進(jìn)而為其它相關(guān)疾病如腫瘤、糖尿病等領(lǐng)域的血管生成干預(yù)提供重要參考。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R732.2
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本文編號：1381382