本文關(guān)鍵詞：建立CRISPR敲除造血干細胞CCR5基因治療艾滋病新策略　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：艾滋病是全球性的公共衛(wèi)生問題和社會問題。目前的主要治療手段是抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療,這種手段能夠有效地控制艾滋病,但不能徹底清除潛伏狀態(tài)的HIV病毒,并伴有嚴重的耐藥性問題。因此,科學(xué)家們不得不尋找新的抗艾策略。2007年,德國醫(yī)療小組將CCR5(C-C chemokine receptor type 5)基因缺陷的造血干細胞移植給一名患有白血病的艾滋病患者,經(jīng)過長達7年的觀察與檢測未發(fā)現(xiàn)HIV病毒及相關(guān)癥狀。這一案例提示我們CCR5可能是艾滋病治療的理想靶點。另外,由于造血干細胞(Hematopoietic stem cell,HSC)移植在臨床上得到成熟的應(yīng)用,可以治療多種造血統(tǒng)腫瘤及免疫相關(guān)疾病,這一技術(shù)為基因治療提供了優(yōu)秀的平臺。因此,本研究擬建立基于造血干細胞CCR5基因敲除的技術(shù)平臺,并結(jié)合造血干細胞移植建立功能性治愈艾滋病的新策略。為完成功能性治愈艾滋病的臨床前研究,本文將針對多方面的內(nèi)容進行深入探索。本課題將建立高效特異的CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)技術(shù)平臺,對HSC上的HIV輔助受體基因CCR5進行特異性敲除,并利用人源化免疫系統(tǒng)小鼠HIV感染模型初步探索該策略的安全性和有效性。CRISPR系統(tǒng)由兩部分組成:介導(dǎo)識別的sgRNA(single guide RNA)和負責(zé)切割的Cas9蛋白。CRIPSR具有切割效率高和操作簡便的特點,本文需要針對每個位點設(shè)計gRNA即可,Cas9蛋白則是通用的。首先在細胞系中篩選出具有高效切割能力、靶向CCR5基因的CRISPR/sgRNA;然后利用免疫缺陷小鼠模型驗證該基因編輯體系的安全性和有效性;通過HIV攻毒實驗該策略對HIV病毒感染的抵御能力;最后,針對臨床前研究的需求從多方面檢測該基因編輯體系的常規(guī)安全性。本文將得到經(jīng)過安全性驗證的、具有抵抗HIV感染能力的CCR5基因靶向的CRISPR基因修飾體系,為該療法進入臨床研究和應(yīng)用打下了堅實的基礎(chǔ)。本課題將以CCR5為靶點,聯(lián)合CRISPR/Cas9技術(shù)和造血干細胞移植治療方案,建立功能性治愈艾滋病的新策略,以期建立一種更為安全和有效的艾滋病治療技術(shù)。首先,本文中設(shè)計和構(gòu)建多個靶向CCR5基因的gRNA表達載體,建立高度純化、無內(nèi)毒素Cas9和gRNA載體,建立導(dǎo)入細胞的技術(shù)方法以及靶基因誘變效率檢測系統(tǒng)。其次,優(yōu)化人造血干/祖細胞(Hematopoietic Stem/Progenitor Cells,HSPCs)的分離純化方案。另外,建立造血干細胞基因敲除及效率檢測平臺。然后,基于免疫缺陷小鼠優(yōu)化人源化動物模型,建立具有高度造血系統(tǒng)人源化的小鼠模型以及HIV病毒感染與檢測技術(shù)體系。接下來,篩選出誘變效率高、特異性好、可賦予細胞HIV-1抗性的CCR5靶向CRISPR。最后,在CCR5誘變造血干細胞移植小鼠模型上檢測評估對HIV-1感染的抵抗作用,檢測病毒載量、CD4+T細胞計數(shù)與對照組的差異,并觀察小鼠體內(nèi)CCR5突變細胞的選擇富集效應(yīng)。本文針對人CCR5基因設(shè)計了45個sgRNA。將CRISPR/Cas9體系所需質(zhì)粒采用核轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)染到K562細胞中,經(jīng)過2 3天的培養(yǎng)后提取基因組并PCR擴增CCR5基因上的對應(yīng)修飾片段,用T7E1酶切和測序的方法檢測該基因的切割效率。經(jīng)檢測,CRISPR切割效率可以達到50%左右。選取最優(yōu)的CRISPR進行后續(xù)的造血干細胞轉(zhuǎn)染實驗。通過對現(xiàn)有CRISPER系統(tǒng)進行優(yōu)化,將兩個gRNA導(dǎo)向Cas9對靶序列進行雙鏈切割,從而提高靶序列的敲除效率。在同一批次的CD34+細胞中,優(yōu)化后的體系對CCR5序列的切割效率可高達32%。本文開展了CCR5基因修飾后的人HSPCs的初步安全性評價。(1)通過軟瓊脂培養(yǎng)法檢測經(jīng)過基因編輯處理的細胞是否具有類似于腫瘤細胞和轉(zhuǎn)化細胞系的生長能力,結(jié)果表明修飾后的細胞與正常細胞相似,在軟瓊脂懸浮狀態(tài)下不能擴增生長。通過與對照組進行比較,癌細胞增殖明顯,而CCR5基因修飾的CD34+細胞并未出現(xiàn)增殖跡象,證明其不具有體外致瘤性。(2)在裸鼠體內(nèi)成瘤性評價實驗中未檢測到淋巴瘤及其癥狀。(3)通過染色體核型檢測,實驗組CCR5基因修飾的CD34+細胞并未檢測出核型異常。(4)通過豚鼠過敏試驗,實驗組CCR5基因修飾的CD34+細胞在動物體內(nèi)輸注并未出現(xiàn)過敏癥狀,對照組輸注BSA的動物體內(nèi)均出現(xiàn)明顯的過敏癥癥狀。CCR5基因修飾后的CD34+細胞能夠在免疫缺陷小鼠中重建人的造血細胞并在其中檢測到CCR5敲除。修飾后的CD34+HSPCs移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi),8周后開始檢測移植小鼠的外周血中CD45+細胞占淋巴細胞的比例,分別進行8周,10周,12周及16周的定期檢測。人的CD45細胞長期平均重建效率達40%,最高達90%。同時本文在移植后12周的小鼠外周血檢測到32.2%的CCR5敲除比例。為了進一步評價CCR5的缺失在具有長期重建能力的HSC中的比例,本文針對移植后30 47周的小鼠和二次移植的小鼠進行外周血取樣,分別檢測到31.2%和24.7%。另外,本文成功的實現(xiàn)了CCR5嗜性的BaL-1毒株在人源化小鼠的長期、有效的感染。病毒感染的小鼠的病毒載量達到預(yù)期水平,且保持長期穩(wěn)定。為了檢測該策略在體內(nèi)的抗病毒效果,本文對移植修飾后的CD34+細胞12周左右的小鼠進行Bal-1病毒感染,在感染后2、4、6、8周檢測病毒載量變化。與對照組相比,實驗組小鼠病毒載量在第8周明顯下降。同時,攻毒前后CD4+T細胞明顯富集,CCR5敲除比例明顯升高�？傊�,本文在體外和體內(nèi)水平實現(xiàn)了高效的CCR5基因敲除。本文通過在人CD34+細胞中實現(xiàn)CCR5基因高效、特異性敲除。其次,本文將體外修飾的CD34+細胞移植到小鼠體內(nèi),能夠高效重建出人的造血系統(tǒng),證明體外修飾策略不會影響到造血干細胞的重建能力。另外,在免疫缺陷小鼠體內(nèi)重建的人的外周血單核細胞中檢測到CCR5基因敲除,實現(xiàn)了在體內(nèi)評價體系中敲除CCR5基因的目的。此外,本文在體內(nèi)、體外水平完成了常規(guī)性安全實驗,初步探索了本策略的安全性。在進行臨床試驗之前,本文對該治療策略的安全性方面做初步的評估,提示我們利用CRISPR技術(shù)在CD34+細胞上實現(xiàn)CCR5基因敲除是一種安全的基因修飾方案。人源化小鼠攻毒實驗結(jié)果顯示,在小鼠感染R5噬性HIV-1病毒第8周對照組小鼠病毒載量處于較高水平,而CCR5基因修飾的實驗組小鼠病毒載量明顯下降。該實驗結(jié)果表明利用CRISPR修飾造血干細胞CCR5基因重建的人源化小鼠具有抵御HIV-1病毒感染的能力。因此,本研究表明基于CCR5基因敲除治療艾滋病的新策略能夠在體內(nèi)安全、有效的控制HIV病毒的載量,具有轉(zhuǎn)化到臨床研究的重要價值。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R512.91

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本文編號：1376338