本文關(guān)鍵詞：卡馬拉素抑制腎上腺皮質(zhì)癌的實驗研究　出處：《第三軍醫(yī)大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

  更多相關(guān)文章： 腎上腺皮質(zhì)癌 卡馬拉素 抗腫瘤藥物 Wnt/β-catenin通路

【摘要】：研究背景腎上腺皮質(zhì)癌(adrenocortical cacinoma,ACC)是一種起源于腎上腺皮質(zhì)的惡性腫瘤,占所有惡性腫瘤的0.01%-0.02%。雖發(fā)病率低,但ACC惡性程度高,侵襲性強,起病隱匿,預后差,大多數(shù)患者在發(fā)現(xiàn)腫瘤時已出現(xiàn)局部浸潤和遠處轉(zhuǎn)移,五年平均生存率低于30%,其治療仍以根治手術(shù)為主,但對于轉(zhuǎn)移及進展型ACC缺乏有效的藥物治療手段�，F(xiàn)有的以米托坦為核心藥物的化療方案存在有效率低毒副作用大的缺點。因此,對ACC新藥物的研究變得尤為重要�？R拉素(rottlerin)是一種提取自楸樹的植物多酚,印度傳統(tǒng)醫(yī)學將其當做抗絳蟲藥物。最新研究表明,卡馬拉素具有抗腫瘤活性,這種抗腫瘤作用是通過多通路多機制來實現(xiàn)的,其中包括對Wnt/β-catenin通路的抑制。而Wnt/β-catenin通路與ACC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究嘗試在體外細胞實驗和動物實驗中證明卡瑪拉素對ACC皆具有抗腫瘤活性,并初步探討其可能的抗腫瘤機制,以為ACC的治療提供更有效更安全的化療藥物。材料和方法1.體外實驗用CCK-8實驗驗證卡馬拉素對ACC細胞株((NCI-H295R和SW-13)的增殖具有抑制作用,且這種抑制作用具有時間和劑量依賴的特點。Annexin V-PI染色法及AO/EB染色法證明卡馬拉素可促進ACC細胞株的凋亡,且濃度越高,凋亡促進作用越強。流式細胞儀分析卡馬拉素對ACC細胞周期的影響。TRANSWELL實驗及細胞劃痕實驗證明卡馬拉素對ACC細胞的遷移和侵襲作用具有抑制作用。WB實驗證實rottlerin可抑制ACC細胞中Wnt/β-catenin通路關(guān)鍵蛋白β-catenin、LRP6及p-LRP6的表達。2.動物實驗20只(性別不限)4周齡BALB/C nu/nu裸鼠皮下注射SW-13細胞構(gòu)筑ACC移植瘤模型,待移植瘤長徑增長至約4mm時將裸鼠隨機分為4組(對照組、DMSO組、Rottlerin 4 mg/kg組以及Rottlerin 2 mg/k g組,每組5只),每日予以腹腔注射,持續(xù)4周,每日1次,對照組注射0.5ml生理鹽水/只/日,DMSO組注射0.45ml+0.05ml DMSO/只/日,Rottlerin 4 mg/kg組及Rottlerin 2 mg/k g組按照裸鼠體重給予卡馬拉素溶液注射。每4天測量1次裸鼠移植瘤大小并監(jiān)測裸鼠體重。4周后處死裸鼠,剝離移植瘤,制成石蠟切片,予以HE染色,觀察成瘤情況,用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導的dUTP缺口末端標記測定法(terminal dexynucleotidyl transferase(Td T)-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)實驗檢測卡馬拉素在移植瘤細胞的凋亡情況。并對各組的腫瘤切片進行β-catenin、LRP6及p-LRP6的免疫組化染色,驗證卡馬拉素可在體內(nèi)抑制ACC細胞中Wnt/β-catenin通路關(guān)鍵蛋白β-catenin、LRP6及p-LRP6的表達。結(jié)果1.卡馬拉素可在體外抑制ACC細胞的增殖,且這種抑制作用具有時間依賴性和劑量依賴性,48h IC50分別為NCI-H295R:5.02μM、SW-13:4.87μM�？R拉素在體外可促進ACC細胞的凋亡,經(jīng)2.5μM卡馬拉素處理48小時后,NCI-H295R和SW-13細胞的凋亡率達到13.0%和10.9%,這一比例在5μM組中為43.3%和38.3%,顯著高于正常對照組。AO/EB實驗結(jié)果不但驗證了這一結(jié)論,也從形態(tài)學上證明卡馬拉素可促進ACC細胞的凋亡。2.經(jīng)5μM卡馬拉素處理48小時的ACC細胞發(fā)生明顯的G0/G1期阻滯,G1期細胞比例分別為NCI-H295R:85.14%、SW-13:81.88%,顯著高于對照組(p0.05)。TRANSWELL實驗和細胞劃痕實驗證實經(jīng)5μM處理24h后ACC細胞的遷移能力明顯下降,遷移細胞數(shù)以及遷移率顯著低于對照組(p0.05)。3.WB實驗證實卡馬拉素可在體外抑制ACC細胞中β-catenin、LRP6及p-LRP6的表達。在經(jīng)過2.5μM,5μM,10μM卡馬拉素處理48小時后這3種蛋白的表達量與對照組相比明顯下降,且隨著藥物濃度的升高,抑制作用越明顯。4.Rottlerin可抑制裸鼠ACC移植瘤的生長。經(jīng)腹腔注射藥物4周后,4個組的裸鼠皆存活,未觀察到明顯毒副反應,且體重無顯著差異。腫瘤平均大小分別為:對照組3.23 cm3,DMSO組3.35 cm3,rottlerin 4 mg/kg組1.56 cm3,rottlerin 4 mg/kg組1.94 cm3。TUNEL實驗結(jié)果提示卡馬拉素可以促進ACC細胞的凋亡,在TUNEL法染色的腫瘤切片中,注射卡馬拉素的裸鼠腫瘤切片中凋亡細胞數(shù)量顯著多于對照組及DMSO組(p0.05),且rottlerin 4 mg/kg組裸鼠腫瘤切片中凋亡細胞數(shù)量顯著多于rottlerin 2mg/kg組(p0.05)。免疫組化染色結(jié)果提示在rottlerin 4 mg/kg組及rottlerin2mg/kg組中β-catenin、LRP6及p-LRP6的表達量較對照組和DMSO組顯著下降(p0.05),且rottlerin 4 mg/kg組中β-catenin、LRP6及p-LRP6的表達量顯著低于rottlerin 2 mg/kg組(p0.05)。結(jié)論卡馬拉素在體外細胞實驗中能夠抑制ACC細胞的增殖,凋亡,使其發(fā)生細胞G0/G1期阻滯,抑制ACC細胞的遷移及侵襲能力,在動物實驗中,腹腔注射卡馬拉素4周的裸鼠未出現(xiàn)明顯毒副作用,卡馬拉素可抑制裸鼠ACC移植瘤的生長,且促進移植瘤細胞的凋亡。體外細胞WB實驗及動物實驗腫瘤切片免疫組化皆提示卡馬拉素可抑制Wnt/β-catenin通路關(guān)鍵蛋白β-catenin、LRP6及p-LRP6的表達。這些結(jié)果提示卡馬拉素對ACC具有抗腫瘤作用,這一作用可能是通過抑制Wnt/β-catenin通路來實現(xiàn)的。因為卡馬拉素有在人類中使用的歷史,且未見毒副反應的報道,且本研究又驗證了其在裸鼠中未見明顯毒副反應,故卡馬拉素因為其低毒副作用和較高的抗腫瘤活性而成為ACC新的抗腫瘤藥物。
[Abstract]:In vitro and in vivo experiments , the effects of Camarlin on ACC cell cycle were studied . The apoptosis rate of ACC cells in ACC cells was significantly lower than that of control group ( P < 0.05 ) . The expression of 尾 - catenin , LRP6 and p - LRP6 in nude mice was significantly lower than that in control group and DMSO group ( P < 0.05 ) .

【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R736.6

【相似文獻】

相關(guān)博士學位論文 前1條

1 朱沂;卡馬拉素抑制腎上腺皮質(zhì)癌的實驗研究[D];第三軍醫(yī)大學;2017年

，

本文編號：1374010