本文關(guān)鍵詞：載紫杉醇靶向相變納米粒聯(lián)合聚焦超聲開(kāi)放血腦屏障治療鼠腦膠質(zhì)瘤　出處：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：第一部分轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾載紫杉醇相變納米粒的制備及性能測(cè)定目的1.制備一種以轉(zhuǎn)鐵蛋白為靶向配體、以紫杉醇為裝載藥物、以液態(tài)全氟戊烷為內(nèi)核的相變型聚乳酸羥基乙酸納米粒(Tf-PTX-PFP-PLGA),并對(duì)其一般性質(zhì)進(jìn)行測(cè)定。2.研究載PFP納米粒體外熱致相變及聲致相變效能。3.研究納米粒體外靶向鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的能力和對(duì)細(xì)胞的毒性作用。方法1.采用雙乳化法和碳二亞胺法合成制備Tf-PTX-PFP-PLGA,使用普通光學(xué)顯微鏡和透射電鏡(TEM)觀察納米粒形態(tài);動(dòng)態(tài)光散射法檢測(cè)粒徑分布和ZETA電位;高效液相色譜法(HPLC)檢測(cè)PTX包封率、載藥量及經(jīng)聚焦超聲輻照(Focused ultrasound,FUS)后藥物釋放的特性;免疫熒光法觀察Tf是否被成功修飾于納米粒表面,流式細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)連接成功率。2.以加熱板加熱的方式在顯微鏡下觀察納米粒體外熱致相變特性;超聲診斷儀采集輻照前及經(jīng)不同聲壓(0.5mpa、1.0mpa、1.5mpa)、不同時(shí)長(zhǎng)(1min、3min、5min)fus輻照后納米粒b超及照影模式圖像,利用dfy軟件分析灰度值及聲強(qiáng)值。3.流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)鼠c6膠質(zhì)瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(transferrinrecepter,tfr)表達(dá)情況;激光共聚焦觀察tf-ptx-pfp-plga、ptx-pfp-plga及tf-ptx-pfp-plga+freetf3組各自納米粒體外靶向c6的能力;cck8法檢測(cè)各ptx制劑對(duì)細(xì)胞的毒性作用。結(jié)果1.光鏡下觀察見(jiàn)納米粒形態(tài)規(guī)則,大小較均一,呈球形,分散性較好,透射電鏡觀察可見(jiàn)較明顯的殼核結(jié)構(gòu)和包裹于內(nèi)部的pfp;平均粒徑(352.3±14.6)nm、平均zeta電位(-24.3±0.4)mv;包封率(63.3±1.8)%,載藥量(3.7±0.1)%;超聲作用能促進(jìn)納米粒的藥物釋放;激光共聚焦觀察納米粒與抗體兩者熒光重合良好,流式結(jié)果示抗體結(jié)合率99.29%±0.46%。2.當(dāng)加熱至48℃時(shí),顯微鏡下可見(jiàn)納米粒轉(zhuǎn)變?yōu)槲馀?經(jīng)fus輻照后,b-mode示納米粒懸液由無(wú)回聲轉(zhuǎn)變?yōu)閺?qiáng)回聲,造影模式可見(jiàn)增強(qiáng)影像。定量分析示1.0mpa+3min組輻照后灰度值和聲強(qiáng)值最大。3.流式結(jié)果示鼠c6膠質(zhì)瘤細(xì)胞tfr表達(dá)陽(yáng)性率為(98.87±0.57)%;激光共聚焦觀察體外尋靶結(jié)果示靶向納米粒組與c6結(jié)合量較非靶向組與競(jìng)爭(zhēng)性抑制組明顯增多。cck8結(jié)果示tf-ptx-pfp-plga對(duì)c6的細(xì)胞毒性最強(qiáng)。同時(shí),非載藥tf-pfp-plga對(duì)c6的增殖影響較小,安全性良好。結(jié)論成功制備tf-ptx-pfp-plga納米粒,其具備熱致相變及聲致相變能力,其體外靶向鼠c6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的能力良好,并能特異性殺傷該細(xì)胞。第二部分相變型納米粒聯(lián)合聚焦超聲開(kāi)放血腦屏障的體內(nèi)研究目的探究相變型納米粒聯(lián)合fus開(kāi)放sd大鼠血腦屏障(bloodbrainbarrier,bbb)的可行性,尋找安全有效的輻照參數(shù),測(cè)定bbb開(kāi)放時(shí)間窗,同時(shí)嘗試比較bbb開(kāi)放形態(tài)與使用傳統(tǒng)脂質(zhì)體微泡時(shí)的差異。方法1.使用鼠腦立體定位儀及牙科鉆對(duì)51只sd大鼠進(jìn)行顱骨開(kāi)窗。2.24只隨機(jī)均分為3組,靜脈注射納米粒后聯(lián)合0.5mpa、1.0mpa、1.5mpa聚焦超聲(focusedultrasound,fus,1mhz)行腦組織輻照,輻照時(shí)長(zhǎng)3min。輻照后靜脈注射尹文氏藍(lán)(evansblue,eb),通過(guò)eb在靶區(qū)滲出情況了解不同聲壓作用下bbb開(kāi)放與否。每組選取5只,定量分析eb滲出量。每組剩余3只行he染色,了解相變型納米粒聯(lián)合不同聲壓的聚焦超聲對(duì)腦組織的影響,篩選出安全、有效的聲壓值。3.24只隨機(jī)均分為2組,分別接受時(shí)長(zhǎng)為3min或5min的超聲輻照,聲壓1.0mpa,輻照結(jié)束后分別于0h、1h、2h、4h取每組中3只行eb染色,測(cè)定eb滲出量。4.另取3只sd大鼠行fus聯(lián)合傳統(tǒng)脂質(zhì)微泡(mbs)開(kāi)放bbb,比較兩者的eb滲出在分布形態(tài)上的差異。結(jié)果1.輻照后立即行eb染色,0.5mpa組輻照目標(biāo)區(qū)域腦組織未見(jiàn)eb滲出,1.0mpa組與1.5mpa組可見(jiàn)明顯的eb滲出,且1.5mpa組相較于1.0mpa組eb滲出的程度加深且范圍擴(kuò)大。三組eb滲出量分別為(5.9±0.7)μg/g,(9.9±2.0)μg/g和(31.8±4.9)μg/g,相較于對(duì)照組,0.5mpa組p0.05,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;1.0mpa組p0.05,1.5mpa組p0.001,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.he染色:0.5mpa組和1.0mpa組鏡下均未見(jiàn)紅細(xì)胞滲出或組織損傷,1.5mpa組鏡下見(jiàn)明顯紅細(xì)胞滲出帶和散在的微小顱內(nèi)血腫,同時(shí)見(jiàn)較為明顯的腦組織液化、壞死。3.時(shí)間窗:0h處eb滲出既達(dá)最大值,隨時(shí)間延長(zhǎng),eb滲出呈先快后慢的趨勢(shì)逐漸降低,3min組于1h內(nèi)輻照側(cè)eb滲出降至與對(duì)側(cè)相同水平,5min組0h點(diǎn)eb滲出較3min組明顯增多,且時(shí)間窗延長(zhǎng)至4h。4.eb滲出分布的對(duì)比顯示,相變型納米粒具有較好的聚焦效能。結(jié)論成功實(shí)現(xiàn)相變型納米粒聯(lián)合fus(1mhz)開(kāi)放sd大鼠腦bbb,在滿足安全有效的前提下,1.0mpa為最優(yōu)聲壓值,為后續(xù)治療實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。第三部分載紫杉醇相變納米粒聯(lián)合聚焦超聲治療鼠膠質(zhì)瘤的體內(nèi)研究目的探討tf-ptx-pfp-plga納米粒聯(lián)合fus對(duì)于sd大鼠c6顱內(nèi)原位膠質(zhì)瘤的治療效果。方法1.顱內(nèi)原位膠質(zhì)瘤模型建立:在鼠腦立體定位儀協(xié)助下,通過(guò)穿刺注射的方式將c6細(xì)胞接種于sd腦組織內(nèi),通過(guò)核磁掃描和he染色進(jìn)行驗(yàn)證,通過(guò)免疫組織化學(xué)法測(cè)定腫瘤組織內(nèi)tfr表達(dá)水平。2.6只荷瘤鼠隨機(jī)均分為2組,分別經(jīng)尾靜脈注射dii標(biāo)記的ptx-pfp-plga和tf-ptx-pfp-plga,激光共聚焦顯微鏡觀察各組納米粒在腫瘤組織內(nèi)的分布情況。3.40只荷瘤鼠隨機(jī)均分入生理鹽水,ptx,ptx-pfp-plga、tf-ptx-pfp-plga和tf-ptx-pfp-plga+fus(1.0mpa+5min)共5組,取每組中5只,于治療前后行核磁掃描觀察各組腫瘤大小變化并記錄生存時(shí)間,每組剩余3只于治療開(kāi)始后10天行HE和TUNEL染色,測(cè)定腫瘤壞死、凋亡情況。4.10只健康SD大鼠隨機(jī)分為兩組,分別行Tf-PFP-PLGA或生理鹽水連續(xù)注射,記錄體重變化,并將主要臟器行HE染色以評(píng)估載體的生物安全性。結(jié)果免疫組化示TfR在鼠C6膠質(zhì)瘤組織中高表達(dá),與流式結(jié)果相符。激光共聚焦顯微鏡下見(jiàn)Tf-PTX-PFP-PLGA較PTX-PFP-PLGA在腫瘤組織內(nèi)分布明顯增多。MRI示5組治療組中Tf-PTX-PFP-PLGA+FUS組腫瘤生長(zhǎng)明顯減緩。HE及TUNEL染色結(jié)果顯示Tf-PTX-PFP-PLGA+FUS組的腫瘤組織內(nèi)壞死、凋亡程度最高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。中位生存期分別為22天、20天、22天、26天和33天。非載藥Tf-PFP-PLGA相較于生理鹽水組體重增長(zhǎng)無(wú)明顯差異,HE染色示心、肝、脾、肺、腎無(wú)明顯的病理性壞死或損傷。結(jié)論所制備的Tf-PTX-PFP-PLGA相變型納米粒具有良好的體內(nèi)靶向能力,聯(lián)合FUS能有效抑制SD大鼠顱內(nèi)原位C6膠質(zhì)瘤的增殖,促進(jìn)其壞死、凋亡,延長(zhǎng)荷瘤鼠中位生存時(shí)間。而非載藥Tf-PFP-PLGA本身幾乎無(wú)毒,對(duì)健康大鼠的生長(zhǎng)沒(méi)有影響。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R739.41

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本文編號(hào)：1371158