本文關(guān)鍵詞：受體源性氣管上皮細(xì)胞植入對(duì)同種異體氣管移植體狹窄的作用及機(jī)制研究　出處：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 同種異體氣管移植 氣管狹窄 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化 閉塞性氣道疾病 氣管上皮細(xì)胞損傷

【摘要】：研究背景近年來隨著醫(yī)源性氣管狹窄、復(fù)雜性氣管損傷、原發(fā)和繼發(fā)性氣管腫瘤發(fā)病率的增加,臨床上需要進(jìn)行氣管重建的病人也隨之增多。目前氣管重建的方法有很多,但均存在各種問題。其中同種異體氣管移植可以在氣管組織結(jié)構(gòu)和功能方面進(jìn)行重建,能克服氣管重建過程中的大部分問題,因此具有較好的臨床應(yīng)用前景。而由閉塞性氣道疾病(Obliterative Airway Disease,OAD)引起的氣管移植體纖維瘢痕狹窄是同種異體氣管移植手術(shù)的主要術(shù)后并發(fā)癥,也是制約氣管移植在臨床上廣泛應(yīng)用的主要原因。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial to Mesenchymal Transition,EMT)指上皮細(xì)胞在細(xì)胞生物學(xué)上表現(xiàn)為失去其自身的上皮細(xì)胞特性而獲得間質(zhì)細(xì)胞的表型,在分子生物學(xué)上表現(xiàn)為上皮細(xì)胞固有的標(biāo)志物表達(dá)水平降低,間質(zhì)細(xì)胞相關(guān)的標(biāo)志物表達(dá)水平增高,以及與EMT有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生了激活。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,EMT這一現(xiàn)象在生物組織的胚胎發(fā)育、惡性腫瘤的侵襲以及組織的纖維化過程中廣泛存在。由于同種異體氣管移植后,其典型的特征就是狹窄的移植體管腔內(nèi)有大量的纖維結(jié)締組織生成,而且也有研究表明,人原代支氣管上皮細(xì)胞在轉(zhuǎn)化生長因子β1(Transforming Growth Factor-β1,TGF-β1)作用下,可以發(fā)生EMT,據(jù)此我們推斷,EMT很有可能是導(dǎo)致氣管同種異體移植體發(fā)生狹窄的一個(gè)重要因素。此外還有研究表明,氣管內(nèi)上皮組織的完整程度與氣管管腔狹窄程度呈負(fù)相關(guān),即氣管內(nèi)上皮組織的完整程度越低,移植后氣管移植體的狹窄程度也越高,這說明供體氣管上皮細(xì)胞的損傷,可以最終導(dǎo)致氣管移植體的狹窄。但對(duì)于氣管上皮細(xì)胞的損傷,是否可以通過誘導(dǎo)EMT從而導(dǎo)致移植體狹窄,目前所知甚少;而植入受體源性的氣管上皮細(xì)胞,是否能抑制EMT從而緩解移植體狹窄,也仍然未知。目的本研究課題的目的在于明確氣管上皮細(xì)胞在同種異體氣管移植體狹窄中扮演的角色,以及闡明氣管上皮細(xì)胞植入抑制同種異體氣管移植體發(fā)生狹窄的可能分子生物學(xué)機(jī)制,為臨床上預(yù)防和治療同種異體氣管移植體狹窄提供新的思路。方法(1)采用Accutase酶消法分離Wistar大鼠原代氣管上皮細(xì)胞并加以培養(yǎng)。(2)建立SD-Wistar大鼠同種異體皮下異位移植模型,SD-SD大鼠同系異體皮下異位移植模型,以及SD-Wistar大鼠受體源性上皮細(xì)胞植入同種異體皮下異位移植模型(在移植后第6天植入Wistar大鼠原代氣管上皮細(xì)胞)。然后在移植后第7、14、30天,處死各組實(shí)驗(yàn)大鼠,取出氣管移植體,一部分用于石蠟包埋,另一部分提取總RNA和提純總蛋白。然后石蠟切片后行蘇木素-伊紅(Hematoxylin-Eosin,HE)染色,用病理圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)移植體氣管上皮細(xì)胞覆蓋比率、氣管管腔狹窄和炎性細(xì)胞浸潤程度。(3)石蠟切片后行免疫組織化學(xué)(Immunohistochemistry,IHC)染色,檢測(cè)上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin以及間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物vimentin的表達(dá)以及定位。提取總蛋白后行Western Blot檢測(cè),半定量分析E-cadherin和vimentin的表達(dá)。(4)提取總RNA,并反轉(zhuǎn)錄成c DNA,實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction,q RT-PCR)檢測(cè)EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子ZEB1、ZEB2、Snail1、Snail2、Twist1的m RNA表達(dá)水平,并進(jìn)一步實(shí)施Western Blot以檢測(cè)ZEB1的蛋白表達(dá)水平。(5)q RT-PCR檢測(cè)TGF-β信號(hào)通路相關(guān)分子的表達(dá)水平,包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3以及轉(zhuǎn)化生長因子β1受體(Transforming Growth Factor-βReceptor1,TGFBR1)的m RNA表達(dá),以及Western Blot檢測(cè)smad3和p-smad3的蛋白表達(dá)。結(jié)果(1)摸索出Accutase酶消法分離大鼠氣管上皮細(xì)胞的最佳培養(yǎng)條件,成功地培養(yǎng)了Wistar大鼠原代氣管上皮細(xì)胞。(2)成功建立了大鼠氣管背部皮下異位移植模型。組織病理學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),同系異體移植物組織病理結(jié)構(gòu)基本接近正常,而同種異體移植物氣管纖毛上皮細(xì)胞數(shù)量逐漸減少,管腔狹窄和炎性細(xì)胞浸潤程度也逐漸加重。當(dāng)植入受體源性的氣管上皮細(xì)胞后,氣管纖毛上皮細(xì)胞數(shù)量得到了恢復(fù),管腔狹窄和炎性細(xì)胞浸潤程度也得到了緩解。(3)IHC檢測(cè)發(fā)現(xiàn)E-cadherin主要在上皮細(xì)胞中表達(dá),而vimentin主要在間質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)。同系異體移植物E-cadherin表達(dá)量很高,而同種異體移植物E-cadherin表達(dá)量逐漸降低,植入受體源性的氣管上皮細(xì)胞后,E-cadherin的表達(dá)量有所回升。而vimentin的表達(dá)剛好和E-cadherin的表達(dá)相反,這一表達(dá)趨勢(shì)在Western Blot檢測(cè)中得到了驗(yàn)證。(4)q RT-PCR檢測(cè)EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)改變情況,與同系異體移植物相比,同種異體移植物中EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(ZEB1、ZEB2、Snail1、Snail2、Twist1)表達(dá)水平都有所增高,其中ZEB1的增高最為明顯。而植入受體源性的氣管上皮細(xì)胞后,可以抑制EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá),其中對(duì)ZEB1抑制作用最為明顯,這一結(jié)論也在Western Blot檢測(cè)中得到了驗(yàn)證。(5)檢測(cè)了TGF-β信號(hào)通路相關(guān)分子的表達(dá)情況,與同系異體移植物相比,在同種異體氣管移植物中TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3表達(dá)均增高(其中TGF-β1的表達(dá)增高最為明顯),TGFBR1表達(dá)水平也相應(yīng)增高,而且smad3的磷酸化水平也有所增高。當(dāng)植入受體源性的氣管上皮細(xì)胞后,TGF-β1和TGFBR1的表達(dá)水平降低,smad3的磷酸化水平也相應(yīng)降低。結(jié)論(1)建立同種異體氣管異位移植動(dòng)物模型后,供體氣管上皮細(xì)胞會(huì)發(fā)生損傷,氣管管腔會(huì)發(fā)生狹窄和梗阻;(2)受體源性的氣管上皮細(xì)胞植入,可以抑制大鼠同種異體氣管移植體發(fā)生狹窄;(3)氣管上皮細(xì)胞損傷激活的TGF-β-Smad信號(hào)通路可能是導(dǎo)致其發(fā)生EMT以及移植體發(fā)生狹窄的重要分子學(xué)機(jī)制;(4)受體源性的氣管上皮細(xì)胞植入,可以通過抑制TGF-β-Smad信號(hào)通路來緩解EMT,從而減輕大鼠同種異體氣管異位移植后管腔狹窄程度。
[Abstract]:In recent years , with the increase of the incidence of endotracheal stenosis , complicated tracheal injury , primary and secondary tracheal tumors , there have been many problems in the clinical application of tracheal transplantation . ( 2 ) To establish SD - Wistar rat allogeneic subcutaneous ectopic transplantation model , SD - SD rat model of allogeneic subcutaneous ectopic transplantation , and SD - Wistar rat receptor - derived epithelial cells implanted in rat primary tracheal epithelial cells . The expression level of expression of E - cadherin and vimentin was detected by Western Blot . ( 2 ) The expression of E - cadherin in tracheal epithelial cells was significantly decreased , and the expression level of E - cadherin increased gradually . The expression level of E - cadherin was significantly increased after implantation of receptor - derived tracheal epithelial cells . Conclusion ( 1 ) The expression level of TGF - 尾1 , TGF - 尾2 and TGF - 尾3 in tracheal epithelial cells is increased , and the phosphorylation level of smad3 is increased .

【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R653
，

本文編號(hào)：1370691