發(fā)布時間：2018-01-02 20:00

  本文關(guān)鍵詞：黃芪甲苷對乙醇誘導(dǎo)的大鼠胃粘膜損傷的保護作用及機制研究　出處：《廣州中醫(yī)藥大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：研究背景:隨著生活水平的不斷提高,國民對酒精的消費日益增加,飲酒人群的消化道疾病發(fā)病率明顯高于非飲酒人群,飲酒導(dǎo)致的急性胃潰瘍與胃粘膜損傷性疾病的發(fā)病人數(shù)日益增高,胃粘膜是胃的重要生理屏障,胃粘膜損傷是多種胃病的首發(fā)環(huán)節(jié)。中醫(yī)藥治療胃粘膜損傷性疾病歷史悠久,臨床經(jīng)驗豐富,具有一定的優(yōu)勢和特色,研究乙醇相關(guān)胃粘膜損傷的中醫(yī)藥防治方法能夠解決現(xiàn)實的臨床需求。作為經(jīng)典補氣類中藥,黃芪治療脾胃系統(tǒng)疾病古已有之,如以黃芪為主藥的黃芪建中湯,補中益氣湯等能治療腹痛、腹瀉、痞滿等病證。作為黃芪內(nèi)含的主要生物活性物質(zhì),黃芪甲苷具有多重的生物功能,包括調(diào)節(jié)免疫、強心、抗病毒、降糖、抗衰老、抗腫瘤等。課題組的前期研究表明,黃芪苷類對胃粘膜損傷具有很好的保護作用,黃芪甲苷與黃芪總苷可以促進乙醇誘導(dǎo)的人胃上皮細胞GES-1損傷的修復(fù)。因此,本文在前期研究的基礎(chǔ)上,運用動物模型,探討黃芪甲苷保護乙醇性胃粘膜損傷的作用途徑及其內(nèi)在的分子機制。目的:觀察黃芪甲苷對乙醇誘導(dǎo)的大鼠胃粘膜損傷的保護作用,探討黃芪甲苷在保護乙醇誘導(dǎo)的大鼠胃粘膜損傷過程中的抗炎作用、抗線粒體氧化應(yīng)激作用及抗細胞凋亡作用及其機制。方法:1、黃芪甲苷對乙醇誘導(dǎo)的大鼠胃粘膜損傷的保護作用研究。建立乙醇誘導(dǎo)大鼠胃粘膜損傷及黃芪甲苷腹腔注射干預(yù)模型,雄性SD成年大鼠,按體重隨機區(qū)組分為7組:1)正常組、2)模型組、3)溶劑組、4)AS-Ⅳ 4(高劑量4mg/kg)組、5)AS-Ⅳ 2(中劑量2mg/kg)組、6)AS-Ⅳ 1(低劑量1mg/kg)組、7)OME(奧美拉唑陽性藥)組,每組8只。正常組、模型組、溶劑組予生理鹽水,AS-Ⅳ 4組、AS-Ⅳ 2組、AS-Ⅳ 1組分別予黃芪甲苷注射液4mg/kg、2mg/kg、1mg/kg,奧美拉哩組予奧美拉唑注射液40mg/kg,連續(xù)腹腔注射干預(yù)4d,1次/天。第3天干預(yù)后大鼠禁食不禁水,第4天干預(yù)后禁水,75min后除正常組外各組予無水乙醇灌胃(5ml/kg),正常組予同等量的生理鹽水灌胃,1h后脫頸處死,開腹取胃,沿胃大彎剪開,鹽水浸洗后肉眼觀察胃粘膜損傷情況,并用電子卡尺對損傷部位進行測量,按Guth法計算胃粘膜損傷分數(shù);取各組相同部位的胃粘膜組織進行病理染色觀察組織損傷情況。2.黃芪甲苷在保護乙醇誘導(dǎo)的胃粘膜損傷過程中的抗炎作用研究。運用乙醇誘導(dǎo)大鼠胃粘膜損傷及黃芪甲苷腹腔注射干預(yù)模型,取各組大鼠相同部位胃組織,勻漿后檢測MPO活力及炎癥因子TNF-α、IL-1 β、IL-10的含量,并檢測炎癥相關(guān)蛋白NF-κ B p65的表達情況。3、黃芪甲苷在保護乙醇誘導(dǎo)的胃粘膜損傷過程中的抗線粒體氧化應(yīng)激作用研究。運用乙醇誘導(dǎo)大鼠胃粘膜損傷及黃芪甲苷腹腔注射干預(yù)模型,取各組大鼠相同部位胃粘膜組織,運用線粒體分離純化試劑盒提取純化胃組織細胞線粒體,并以線粒體為研究對象,運用免疫熒光法及比色法檢測線粒體氧化應(yīng)激指標SOD活力及GSH、MDA的含量。4、黃芪甲苷在保護乙醇誘導(dǎo)的胃粘膜損傷過程中的抗細胞凋亡作用研究。運用乙醇誘導(dǎo)大鼠胃粘膜損傷及黃芪甲苷腹腔注射干預(yù)模型,取各組相同部位胃組織,TUNEL染色觀察細胞凋亡情況;運用免疫印跡法檢測各組胃組織細胞胞漿中凋亡相關(guān)因子Bid、AIF、細胞色素C的表達情況;運用比色法檢測各組胃組織胞漿中Caspase3、Caspase9的活力;運用RT-PCR法檢測胃組織凋亡相關(guān)基因Bid mRNA、Cyt-C mRNA、AIFmRNA、Bcl-2mRNA、BaxmRNA的表達情況;提取胃組織細胞線粒體,檢測各組線粒體凋亡蛋白Bcl-2、Bax的表達情況及線粒體膜電位的變化。結(jié)果:1.大鼠胃粘膜經(jīng)乙醇刺激后損傷嚴重,粘膜表面多呈暗紅色,并可見條索狀、線狀、點狀出血;病理學(xué)顯示模型大鼠胃粘膜組織損傷明顯,上皮細胞固有層分離、組織壞死、水腫、出血,粘膜細胞出現(xiàn)核固縮甚至溶解,粘膜下層腺體損傷且排列不規(guī)則、毛細血管擴張、壓縮;模型組與溶劑組胃粘膜損傷程度無差異;胃粘膜損傷Guth評分及光鏡下?lián)p傷分數(shù)比較,AS-Ⅳ 4組、AS-Ⅳ 2組明顯低于模型組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),AS-Ⅳ 1組與模型組比較無明顯差異。2.乙醇誘導(dǎo)損傷的大鼠胃組織中MPO活力及炎癥因子TNF-a、IL-1β濃度高于正常組,IL-10濃度低于正常組,NF-κBp65蛋白較正常組表達升高;溶劑組與模型組無差異;AS-Ⅳ 4組、AS-Ⅳ 2組、AS-Ⅳ 1組MPO活力較模型組降低(P＜0.05);AS-Ⅳ 4 組、AS-Ⅳ 2 組 TNF-a、IL-1β 濃度較模型組降低(P＜0.05),AS-Ⅳ 1 組TNF-a、IL-1β濃度與模型組比較無差異;AS-Ⅳ 4組IL-10含量較模型組升高(P0.05),AS-Ⅳ 2、AS-Ⅳ1組IL-10含量與模型組比較無差異。3.乙醇誘導(dǎo)的胃粘膜損傷大鼠胃組織細胞線粒體SOD活力及GSH含量下降、MDA含量上升(P＜0.05);溶劑組與模型組無差異;AS-Ⅳ 4組較模型組相比GSH含量升高(P＜0.05),AS-Ⅳ 2組及AS-Ⅳ 1組GSH含量與模型組比較無差異;AS-Ⅳ 4組、AS-Ⅳ 1組較模型組相比MDA含量下降(P0.05),AS-Ⅳ 2組MDA含量與模型組比較無差異;各給藥組較模型組相比,SOD活力無明顯差異。4.TUNEL染色顯示模型組大鼠胃組織細胞凋亡率明顯高于正常組(P＜0.01);溶劑組與與模型組無差異;AS-Ⅳ 4組、AS-Ⅳ 2組胃組織細胞凋亡率較模型組明顯降低(P0.05);AS-Ⅳ 1組與模型組比較無顯著差異。乙醇誘導(dǎo)的胃粘膜損傷大鼠胃組織細胞胞漿中Caspase 3和Caspase 9活力顯著升高(P0.01),溶劑組與模型組無差異;AS-Ⅳ 4組、AS-Ⅳ 2組及AS-Ⅳ 1組Caspase-9活力較模型組均明顯降低(P0.05);AS-Ⅳ 4組、AS-Ⅳ 2組Caspase-3活力較模型組顯著降低(P0.01),AS-Ⅳ 1組與模型組比較無差異。乙醇誘導(dǎo)的胃粘膜損傷大鼠胃組織細胞線粒體膜電位明顯下降;AS-Ⅳ 4組較模型比較,線粒體膜電位明顯升高(P0.05)。5.乙醇誘導(dǎo)的胃粘膜損傷大鼠胃組織細胞胞漿Bid蛋白表達明顯減少(P0.01),AS-Ⅳ 4組與模型組比較Bid蛋白的表達顯著升高(P0.01);溶劑組與模型組無差異;AS-Ⅳ 2、AS-Ⅳ 1組與模型組比較無差異。Cyt-C的表達模型組明顯高于正常組(P＜0.01);模型組與溶劑組無差異;AS-Ⅳ 4、AS-Ⅳ 2、AS-Ⅳ 1組均能不同程度的減少Cyt-C的表達(P0.01)。模型組AIF蛋白的表達顯著高于正常組(P0.01);溶劑組與模型組無差異;AS-Ⅳ 4及AS-Ⅳ 2組均能降低AIF的表達(P＜0.05);AS-Ⅳ 1組與模型組比較無差異。線粒體蛋白Bax的表達模型組顯著高于正常組(P0.01);溶劑組與模型組無差異;AS-Ⅳ 4、AS-Ⅳ2、AS-Ⅳ 1組均能不同程度的降低Bax的表達(P＜0.05)。模型組線粒體膜蛋白Bcl-2表達明顯低于正常組(P0.01);溶劑組與模型組無差異;AS-Ⅳ 4組與模型組比較Bcl-2蛋白表達明顯升高(P0.01);AS-Ⅳ 2組與AS-Ⅳ1組與模型組比較無明顯差異。6.乙醇誘導(dǎo)的胃粘膜損傷大鼠胃組織BidmRNA表達顯著升高(P＜0.01);溶劑組與模型組無差異;AS-Ⅳ 4組與模型組比較BidmRNA表達明顯下降(P＜0.01);AS-Ⅳ 2、AS-Ⅳ 1組與模型組無差異。模型組Cyt-CmRNA表達明顯高于正常組(P＜0.01);溶劑組與模型組無差異;AS-Ⅳ 4組較模型組比Cyt-C mRNA表達顯著下降(P0.01);AS-Ⅳ 2、AS-Ⅳ1組與模型組無差異。AIF mRNA的表達模型組顯著高于正常組(P＜0.01);溶劑組與模型組無差異;AS-Ⅳ 4組能顯著下調(diào)AIFmRNA的表達(P0.01);AS-Ⅳ 2、AS-Ⅳ 1組與模型組無差異。經(jīng)乙醇刺激后,大鼠胃組織Bax mRNA的表達顯著升高(P0.01);溶劑組與模型組無差異;AS-Ⅳ 4組較模型組比Bax mRNA表達明顯下降(P0.05);AS-Ⅳ 2、AS-Ⅳ 1組與模型組比較無差異。Bcl-2 mRNA的表達模型組較正常組顯著下降(P0.01);溶劑組與模型組無差異;AS-Ⅳ 4組能顯著上調(diào)Bcl-2 mRNA的表達(P＜0.01);AS-Ⅳ 2、AS-Ⅳ 1組與模型組比較無差異。結(jié)論:1.乙醇誘導(dǎo)的胃粘膜損傷過程中,大鼠胃組織細胞發(fā)生了線粒體氧化應(yīng)激及線粒體途徑的細胞凋亡;黃芪甲苷能夠通過減少線粒體脂質(zhì)過氧化,增加線粒體GSH濃度減輕線粒體氧化應(yīng)激反應(yīng)。2.乙醇誘導(dǎo)胃粘膜損傷過程中,大鼠胃組織發(fā)生了以中性粒細胞聚集、促炎癥細胞因子TNF-α、IL-1β高表達、抑炎癥細胞因子IL-10低表達、炎癥反應(yīng)關(guān)鍵蛋白NF-κB p65高表達為特征的炎癥反應(yīng);黃芪甲苷能夠通過降低MPO活力、減少TNF-α、IL-1β及NF-κBp65的表達,增加IL-10的表達減輕胃組織的炎癥反應(yīng)。3.黃芪甲苷腹腔注射具有保護乙醇誘導(dǎo)的大鼠胃粘膜損傷的作用,這種作用可能與其抗因炎癥及線粒體氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的大鼠胃組織細胞凋亡有關(guān)。
[Abstract]:Background: with the continuous improvement of living standards, the national consumption of alcohol drinking population increasing, digestive tract disease incidence was significantly higher than non drinkers, the incidence of alcohol induced acute gastric ulcer and gastric mucosal injury disease is increasing, gastric mucosa is an important physiological barrier of the stomach, gastric mucosal injury is the first link of gastric diseases. Traditional Chinese medicine treatment of gastric mucosa injury disease has a long history, rich clinical experience, has certain advantages and characteristics, methods of prevention and treatment of alcohol related gastric mucosal injury in traditional Chinese medicine to solve the clinical needs in reality. As a classic of Tonifying Qi herbs, Astragalus in the treatment of diseases of spleen and stomach has existed for a long time, such as Astragalus Astragalus based medicine built in decoction, Buzhongyiqi Decoction to treat abdominal pain, diarrhea, flatulence and other syndromes. As the main bioactive substances containing astragalus, astragaloside with The biological functions, including the regulation of immunity, strong heart, antiviral, hypoglycemic, anti-aging, anti-tumor and so on. Previous studies showed that Astragalus glycoside has good protective effect on gastric mucosal injury, astragaloside and astragaloside can promote the repair of ethanol induced gastric epithelial cell GES-1 damage. Therefore, this paper on the basis of previous studies, using animal models, to investigate the protection of astragaloside in ethanol induced gastric mucosal injury mechanism and molecular mechanism of intrinsic. Objective: To observe the protective effect of Astragaloside on gastric mucosal injury induced by ethanol in rats, to investigate the anti-inflammatory effect of rat gastric mucosa injury Huangqi glycoside in the protection of ethanol induced the anti mitochondrial oxidative stress and anti apoptosis effect and its mechanism. Methods: 1, the protective effect of Astragaloside on gastric mucosal injury induced by ethanol in rats. The establishment of ethanol 璇卞澶ч紶鑳冪矘鑶滄崯浼ゅ強榛勮姫鐢茶嫹鑵硅厰娉ㄥ皠騫查妯″瀷,闆勬，

本文編號：1370689