本文關鍵詞：Erlotinib通過ROS介導JNK通路誘導NSCLC細胞凋亡的機制及臨床研究　出處：《青島大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：肺癌是目前嚴重危害人類健康與生命最大的惡性腫瘤之一,導致人類癌癥相關性死亡的主要原因。以 鉑類‖為主的聯合化療是治療非小細胞肺癌晚期(III B期、IV期)傳統治療的重要基石和主要的手段。隨著肺癌發(fā)生機制研究的逐步深入,肺癌的靶向治療及免疫治療現已成為晚期NSCLC的研究熱點。以表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)為代表的分子靶向藥物臨床應用研究發(fā)現,其可明顯改善晚期NSCLC的生存期,提高生活質量,且此類藥物相關的心臟毒性、骨髓抑制、肝腎功能損害等不良反應明顯減低,現已成為晚期NSCLC的研究熱點。第一代EGFR-TKI應用最廣泛,為可逆的EGFR酪氨酸激酶抑制劑,但是治療平均9個月左右,只要EGFR-TKI治療,都會出現耐藥跡象,一旦出現耐藥,疾病往往迅速進展。因此,如何解決EGFR-TKI耐藥,對臨床治療是非常關鍵且棘手的問題。厄洛替尼(erlotinib)屬于EGFR-TKI其中之一,具有可抑制并減緩腫瘤的生長,也有耐藥問題,隨著研究的深入,但其治療及耐藥機制和通路仍有有不清楚的地方。ROS是人體細胞的有氧呼吸及有氧代謝過程中所產生的活性氧簇,其密切參與多種生理及病理過程的調節(jié)。在某些環(huán)境大量ROS的產生,進而引起細胞內蛋白、細胞器等結構的破壞,可以誘導細胞死亡。因此,臨床常用抗腫瘤的藥物殺傷腫瘤細胞可以直接或間接地通過活性氧簇(ROS)來起作用。同時調節(jié)性T細胞(Treg)/調節(jié)性B細胞((Breg)作為一類具有獨特的免疫負性調節(jié)功能的細胞亞群,在腫瘤的免疫耐受及治療過程中逐漸被認識、利用。大量研究表明,Breg、Treg等免疫細胞在腫瘤微環(huán)境中起著免疫調控作用,其參與腫瘤細胞的存活、增值和轉移。鑒于ROS是誘導腫瘤細胞死亡的重要因素、免疫細胞在腫瘤的免疫耐受及治療中起著重要作用,有關EGFR-TKI誘導的ROS在抗癌中的具體作用和機制以及Treg、Breg等免疫細胞在腫瘤微環(huán)境中的調控機制目前還不完全清楚,亟待深入的研究來闡明,以此來開展腫瘤的新的分子生物治療,以改善患者的預后。目的:厄洛替尼誘導非小細胞肺癌細胞凋亡的治療的作用,并探討其作用機制。第一部分實驗研究厄洛替尼對肺腺癌細胞凋亡及增殖的影響及可能的機制,通過ROS介導JNK通路探討厄洛替尼對該通路的調節(jié)作用,促進腫瘤細胞凋亡,抑制腫瘤細胞增殖,為肺腺癌治療藥物的作用機制及耐藥研究提供理論基礎。第二部分實驗探討調節(jié)性T淋巴細胞(regulatory T cell,Treg)各亞群和調節(jié)性B淋巴細胞(regulatory B cell,Breg)在EGFR陽性肺腺癌患者外周血中的表達水平及口服厄洛替尼藥物的影響。方法:第一部分實驗研究中,研究了ERL對人肺癌A549細胞的抗癌作用及其潛在的機制。MTT法檢測ERL對A549的細胞活性的抑制作用。應用Hoechst33342染色和FACS測定法檢測ERL誘導A549細胞凋亡作用;使用DCFH-DA熒光標記檢測A549細胞內活性氧(reactive oxygen species,ROS)的含量,JC-1染色測量線粒體膜電位(MMP)。通過蛋白質印跡法(Western Blot)測定ERL對JNK蛋白的磷酸化狀態(tài)和下游凋亡相關蛋白的的表達影響。第二部分實驗研究中采集19例晚期肺腺癌患者和20例健康人的外周血樣,通過流式細胞儀分析其外周血中Treg和Breg的比例,分別以CD4+CD25+標記Treg、以CD45RA、CD4、CD25來標記Treg亞群(r Treg,non-Treg,a Treg)、以CD 19+CD24hi CD27+標記Breg。結果:1體外實驗發(fā)現ERL可以顯著抑制A549的細胞生長,且呈現濃度依賴性。Hoechst33342染色證實ERL誘導人非小細胞肺癌細胞凋亡,與藥物濃度相關。將肺癌A549細胞與不同濃度的ERL(0,5,10,15,20,25,30,35,40,45μmol/L)孵育24小時。MTT檢測顯示在體外不同濃度ERL對肺癌A549細胞的增殖產生不同程度的抑制作用,越高濃度的ERL對細胞增殖的作用越明顯,說明ERL的抑制作用有濃度依賴性。我們的實驗研究結果顯示ERL對A549細胞的24h小時半數抑制濃度(IC50)為23.09μg/ml。Hoehcst染色結果顯示,25μmol/L組的染色細胞出現細胞核的碎裂、大小不等的圓形小體,表現出調亡的狀態(tài)。當濃度為45μmol/L時,細胞內調亡小體的形成,細胞破碎,呈高強度藍色熒光�？梢姰敿尤氩煌瑵舛鹊腅RL(0,5,10,15,20,25,30,35,40,45μmol/L)時,凋亡細胞的數量明顯增加,并呈劑量濃度依耐性。不同濃度的ERL組間差異比較,有統計學意義(p0.05),隨ERL濃度的增大,凋亡細胞量逐漸增加。2 ERL通過增加A549細胞內ROS量的產生,激活促進細胞凋亡的JNK信號通路。在加入不同濃度的ERL刺激后,DCFH-DA熒光探針標記A549細胞內ROS量的變化。檢測DCF的熒光強度發(fā)現,隨著ERL濃度的逐漸增加,A549細胞內ROS的生成量明顯增加,組間比較差異有統計意義(p0.05)。表明ERL可以誘導A549細胞內ROS的產生,并對A549細胞內ROS的水平有顯著的作用,同時這種作用隨濃度的不同,其程度也不同,體現為濃度的依耐性。免疫蛋白印跡法顯示ERL組與對照組相比,每個藥物濃度上JNK水平并沒有發(fā)生明顯變化,但JNK磷酸化明顯升高,以濃度依賴方式誘導A549細胞中JNK磷酸化。將條帶的不同強度轉換為光密度(OD)分析后,差異有統計學意義(p0.05)。3我們發(fā)現ERL可以誘導細胞周期停滯在G0/G1期。磷酸化的JNK降低線粒體膜電位和下調抑制細胞凋亡基因Bcl-2的表達,促進細胞凋亡基因Bax的表達上調。此外,ERL誘導JNK的磷酸化進一步增加c-Jun和caspase-3的活化。流式細胞術采用JC-1染色觀察A549細胞中的線粒體膜電位的影響。當線粒體膜的處于高電位狀態(tài)時,JC-1濃聚于線粒體的基質中并形成聚合物樣的結構。而當線粒體膜電位處于低電位狀態(tài)時,JC-1為單體形式存在。通過流式細胞技術檢測發(fā)現,ERL處理后A549細胞線粒體膜電位明顯下降,也呈現為濃度依賴性關系。隨著ERL的濃度升高,線粒體膜電位(MMP)的降低越明顯,差異有統計學意義。流式檢測細胞分期的結果發(fā)現,空白組G1期細胞比例分別為(52.27士3.00%),顯著低于ERL組(81.03士7.88%)(p0.05),而NAC預處理+ERL組G1期細胞比例明顯低于ERL組,其數值(71.34士12.48%)。提示ERL可通過氧化應激反應進而干預A549細胞周期分布,引起G1期阻滯。在ERL經處理24小時后,與對照組相比,在ERL處理組A549細胞中Bcl-2的蛋白表達明顯降低,Bax顯著增加(p0.05)。此外,與對照組相比,ERL處理組中Bcl-2/Bax蛋白的相對比例也有降低(p0.05)。NAC處理后可以明顯逆轉上述ERL對Bcl/Bax表達比例失調。此外,ERL促進A549細胞中c-Jun的磷酸化,細胞內Caspase-3的活性增強。4所有ERL的促凋亡作用通過ROS清除劑NAC應用而逆轉。為了進一步證實ROS的水平變化是ERL引起的重要靶點,我們實驗采用抗氧化劑乙酰半胱氨酸(NAC)從對立面進一步證明。我們實驗給藥方案包括對照組1(空白+no NAC),ERL組(ERL25μmol/L+no NAC),對照組2(NAC)(空白+1mmol/L NAC),ERL+NAC組(ERL25μmol/L+1mmol/L NAC)在加入NAC干預后,細胞內的凋亡受到明顯抑制:下調ROS的水平,逆轉ERL的細胞周期阻滯效應,干預凋亡蛋白(例如Bcl-2,Bax和caspase-3)的活化。從而逆轉ERL的促凋亡作用。5我們第二部分實驗研究發(fā)現19例肺癌患者口服厄洛替尼,其中15例療效評價為部分緩解,3例療效評價為穩(wěn)定。肺癌患者外周靜脈血中血CD4+T淋巴細胞占PBMC的比例較正常對照組明顯升高(p0.001),同時靜脈血中a Treg占CD4+T淋巴細胞的比例較正常對照組升高(p0.05),Breg(CD19+CD24hi CD27+)占CD19+B淋巴細胞的比例較正常對照組明顯升高(p0.001)。靶向治療有效患者,三群Treg及Breg水平均降低,但無統計學意義。結論:我們研究發(fā)現,體外實驗表明ERL通過誘導A549細胞凋亡具有顯著的抗癌作用,且呈現濃度依賴性。其作用的機制為ERL誘導A549細胞內ROS的產生,導致線粒體膜通透性改變,激活JNK蛋白表達,調控Bcl-2、Bax的表達比例,進而激活Caspase-3,通過線粒體介導的細胞凋亡途徑導致腫瘤細胞凋亡。通過臨床病例分析發(fā)現,肺腺癌患者外周血中存在Treg、Breg細胞比例的失調,其中a Treg亞群的比例升高,經體內活化增殖轉變?yōu)榻K末分化狀態(tài)的a Treg,募集至腫瘤組織局部,Breg的比例也表現為升高。Treg和Breg兩類調節(jié)性淋巴細胞所參與的負性免疫調控來下調抗腫瘤免疫監(jiān)控,從而有利于腫瘤的進展。經口服ERL的患者,Treg的亞群及Breg未見明顯變化,需要臨床大數據進一步明確。體內、外實驗均表明ERL具有顯著的抗肺腺癌作用,其對腫瘤發(fā)展過程中抑制作用及其分子機制尚未得到充分闡明。
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【學位授予單位】：青島大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R734.2

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本文編號：1353446