本文關(guān)鍵詞：細(xì)胞選擇性梯度生物材料的構(gòu)建及其調(diào)控細(xì)胞遷移行為研究　出處：《浙江大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：細(xì)胞遷移是生理學(xué)和病理學(xué)中十分重要的過程,與胚胎發(fā)育、血管生成、免疫應(yīng)答以及腫瘤轉(zhuǎn)移等過程息息相關(guān)。生物體內(nèi)細(xì)胞能夠?qū)ι锘瘜W(xué)或生物物理信號(hào)刺激做出響應(yīng)從而進(jìn)行遷移。由于非必要的或過度的細(xì)胞遷移會(huì)導(dǎo)致組織不正確的修復(fù)甚至導(dǎo)致疾病,因此選擇性調(diào)控細(xì)胞遷移非常重要。模擬一些信號(hào)分子對細(xì)胞的作用可望實(shí)現(xiàn)選擇性調(diào)控細(xì)胞遷移,為生物材料設(shè)計(jì)提供理論支持和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。通過聚酯胺解在表面引入氨基,再經(jīng)過戊二醛偶聯(lián),接枝明膠分子。利用注射泵改變胺解時(shí)間,即可在表面構(gòu)建明膠梯度。發(fā)現(xiàn)在明膠密度梯度的表面,內(nèi)皮細(xì)胞(Endothelial cells,ECs)骨架沿梯度方向排列。內(nèi)皮細(xì)胞在明膠密度梯度表面趨向于向明膠分子密度增加的方向遷移。最高有90%的內(nèi)皮細(xì)胞向梯度正方向遷移,遷移速率達(dá)11μm/h。發(fā)現(xiàn)明膠分子密度梯度對于平滑肌細(xì)胞(Smooth muscle cells,SMCs)和成纖維細(xì)胞(Fibroblasts,FIBs)遷移的方向性影響較為顯著,然而對細(xì)胞遷移速率影響并不明顯。結(jié)果證實(shí),單一明膠梯度對于不同細(xì)胞沒有選擇性。之前關(guān)于細(xì)胞選擇性的表面修飾研究都基于模型材料表面,修飾方法較為復(fù)雜�；诘诙鹿ぷ�,提出了一個(gè)具有普適性、更簡單的表面修飾方法。在聚已內(nèi)醋(Polycaprolactone,PCL)膜材料表面沉積一層聚多巴胺,使表面帶有氨基。將透明質(zhì)酸用甲基丙烯酸酐改性后(MA-HA)接枝在聚多巴胺表面以構(gòu)建細(xì)胞阻粘層。精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-纈氨酸(Arg-Glu-Asp-Val,REDV)多肽能夠特異性識(shí)別內(nèi)皮細(xì)胞。REDV多肽修飾巰基后通過邁克爾加成,接枝在MA-HA表面;結(jié)合注射法,構(gòu)建出REDV多肽密度梯度。在REDV多肽接枝表面,內(nèi)皮細(xì)胞粘附數(shù)量可達(dá)到平滑肌細(xì)胞的2.5倍。內(nèi)皮細(xì)胞在REDV多肽密度梯度表面遷移定向性達(dá)到86%,同時(shí)遷移速率增大到細(xì)胞培養(yǎng)板(Tissue culture polystyrenes,TCPS)表面2倍;平滑肌細(xì)胞則表現(xiàn)出沒有定向性的遷移,遷移速率下降50%以上。細(xì)胞片遷移結(jié)果表明內(nèi)皮細(xì)胞片向梯度正方向遷移距離是均勻表面的3倍。成纖維細(xì)胞激活后向血管中層遷移是導(dǎo)致血管外膜纖維化的原因之一。因此,血管受損后選擇性促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的粘附和遷移非常重要。在材料表面構(gòu)建一層聚乙二醇的均勻阻粘分子層,通過共價(jià)接枝梯度固定細(xì)胞特異性多肽,能夠?qū)崿F(xiàn)細(xì)胞的選擇性粘附和遷移。纈氨酸-丙氨酸-脯氨酸-甘氨酸(Val-Ala-Pro-Gly,VAPG)多肽對平滑肌細(xì)胞具有特異選擇性作用。首先通過鹽溶液密度梯度在表面構(gòu)建了一層均勻的聚乙二醇阻粘分子層,末端帶有梯度的疊氮基團(tuán),再通過點(diǎn)擊反應(yīng),將炔基修飾的VAPG多肽接枝在表面。VAPG多肽接枝實(shí)現(xiàn)了對于平滑肌細(xì)胞的選擇性粘附,平滑肌細(xì)胞密度最高可達(dá)成纖維細(xì)胞2倍。VAPG多肽的接枝使平滑肌細(xì)胞遷移速率提高,成纖維細(xì)胞遷移速率降低。平滑肌細(xì)胞遷移速率(22 μm/h)最高達(dá)到相同位置成纖維細(xì)胞遷移速率3倍以上;84%的平滑肌細(xì)胞趨向VAPG多肽接枝密度增加的方向遷移,且平滑肌細(xì)胞有效遷移距離顯著性增大。三維環(huán)境下的細(xì)胞遷移與二維平面上有很大不同。因此模擬細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix,ECM)構(gòu)建相應(yīng)材料來研究細(xì)胞遷移行為具有更重要的意義�；|(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases,MMPs)是在大部分細(xì)胞均有表達(dá)的一類能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白水解酶。在本章中,通過甲基丙烯酸酐改性的透明質(zhì)酸雙鍵和基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)敏感的多肽序列上的巰基邁克爾加成反應(yīng),構(gòu)建了一種對細(xì)胞分泌的MMPs產(chǎn)生響應(yīng)從而降解的水凝膠。通過Transwell模型,考察了平滑肌細(xì)胞在水凝膠內(nèi)的三維遷移情況。平滑肌細(xì)胞在有其他細(xì)胞誘導(dǎo)下,向酶敏感水凝膠內(nèi)部遷移達(dá)120μm。進(jìn)一步研究影響其遷移行為的因素發(fā)現(xiàn),平滑肌細(xì)胞在水凝膠內(nèi)主要以間充質(zhì)方式遷移,MMP-2降解水凝膠導(dǎo)致網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)疏松是細(xì)胞在水凝膠內(nèi)部遷移的主要原因。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明,細(xì)胞向降解程度不同的水凝膠內(nèi)部侵襲方式不同,且侵襲深度隨水凝膠可降解程度增加而增大。在本文中,采用聚合物阻粘層結(jié)合細(xì)胞特異性多肽這一手段,構(gòu)建了兩種細(xì)胞選擇性表面,并成功在生物降解材料聚已內(nèi)酯表面實(shí)現(xiàn)了這一目標(biāo)。多巴胺沉積進(jìn)而偶聯(lián)其他分子具有普適性,因而該表面修飾方法可適用于多種材料表面。進(jìn)一步構(gòu)建的模擬細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境水凝膠,闡明細(xì)胞在其中的三維遷移行為,有助于發(fā)展具有特殊結(jié)構(gòu)和功能的生物材料,以更好地實(shí)現(xiàn)組織再生。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R318.08

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