發(fā)布時(shí)間：2017-12-30 02:07

  本文關(guān)鍵詞：基于人冠狀病毒OC43重組病毒抗病毒高通量篩選平臺(tái)的建立及初步應(yīng)用　出處：《中國(guó)疾病預(yù)防控制中心》2017年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 人冠狀病毒OC43 反向遺傳學(xué) 海腎熒光素酶 抗病毒篩選

【摘要】：冠狀病毒(Coronaviruses,CoVs)是目前已知基因組最大的、有包膜的單股正鏈RNA病毒,其病毒粒子呈球形,基因組全長(zhǎng)27-33 kb。冠狀病毒在自然界中分布廣泛,在人、哺乳動(dòng)物和鳥(niǎo)類(lèi)中均已分離到該類(lèi)病毒。冠狀病毒在感染人和鳥(niǎo)類(lèi)后通常引起呼吸系統(tǒng)疾病,但是在感染其他哺乳類(lèi)動(dòng)物后往往引起消化系統(tǒng)或者神經(jīng)系統(tǒng)疾病。雖然在上個(gè)世紀(jì)30年代和60年代就已經(jīng)分離到了第一個(gè)禽冠狀病毒(Infectious Bronchitis Virus,IBV)和第一個(gè)人冠狀病毒(Human coronavirusOC43,HCoV-OC43),但是直到2003年嚴(yán)重急性呼吸綜合征(Sever acute respiratory syndrome,SARS)在全球范圍內(nèi)的暴發(fā)流行以及豬冠狀病毒的暴發(fā)流行給畜禽養(yǎng)殖業(yè)造成了重大經(jīng)濟(jì)損失,冠狀病毒的感染才越來(lái)越受到人類(lèi)醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)科專(zhuān)家的共同重視。此外,SARS-CoV和MERS-CoV兩種動(dòng)物疫原性病毒的感染也對(duì)人類(lèi)生命健康構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅。然而,目前尚無(wú)有效的藥物能夠治療冠狀病毒引起的感染。因此,亟待建立一種高效的抗冠狀病毒藥物篩選平臺(tái)用于篩選抗冠狀病毒候選藥物。HCoV-OC43是目前已知的能夠感染人的6種冠狀病毒中的一種,與人冠狀病毒HKU1 (HCoV-HKU1)、SARS 冠狀病毒(SARS-CoV)和 MERS 冠狀病毒(MERS-CoV)同屬于β群。因此其基因組與同屬于β群的SARS-CoV和MERS-CoV具有極高的相似性,特別是在冠狀病毒較為保守的復(fù)制酶(nsp12)和解旋酶(nsP13)區(qū)域。因此,HCoV-OC43可以作為一種不依賴(lài)于生物安全三級(jí)(Biological safety level-3, BSL3)實(shí)驗(yàn)室的用來(lái)篩選廣譜抗冠狀病毒藥物的和宿主抗病毒基因的有效工具。病毒反向遺傳操作技術(shù)的建立為研究病毒基因功能和篩選廣譜抗病毒藥物開(kāi)辟了新的途徑。利用反向遺傳操作技術(shù)將外源報(bào)告基因插入病毒基因組中而獲得的重組病毒可用于病毒編碼蛋白的功能、病毒復(fù)制規(guī)律及抗病毒藥物篩選等研究。本文利用反向遺傳學(xué)操作技術(shù)成功獲得了一株穩(wěn)定、高效表達(dá)海腎熒光素酶基因(Renilla luciferase gene,Rluc)的重組冠狀病毒,同時(shí)對(duì)該病毒進(jìn)行了抗冠狀病毒宿主基因篩選和藥物篩選可行性評(píng)價(jià)。最后利用該重組病毒對(duì)藥物庫(kù)進(jìn)行了高通量篩選(HighThroughput Screening,HTS),并成功篩選到了 38個(gè)能夠在10μM藥物濃度下有效抑制HCoV-OC43復(fù)制的藥物。具體內(nèi)容和研究結(jié)果如下:1、重組HCoV-OC43病毒的拯救與篩選通過(guò)重疊PCR的方法將Rluc基因以替換或者插入到HCoV-OC43附屬基因ns2和ns12.9中,成功拯救出了 4株表達(dá)Rluc基因的重組病毒:rOC43-ns2FusionRluc、rOC43-ns2DelRluc、rOC43-ns12.9FusionRluc 和 rOC43-ns12.9StopRluc。其中重組病毒rOC43-ns2DelRluc不僅能夠高效表達(dá)Rluc基因,并且病毒生長(zhǎng)曲線(xiàn)和親本病毒HCoV-OC43-WT類(lèi)似。插入的外源Rluc基因在BHK-21細(xì)胞中和BALB/c小鼠顱內(nèi)連續(xù)傳代的過(guò)程中較為穩(wěn)定。此外,該重組病毒對(duì)BALB/c小鼠的致病性也未發(fā)生改變,顱內(nèi)注射能夠引起小鼠100%死亡。該實(shí)驗(yàn)表明,重組病毒rOC43-ns2DelRluc具有高效表達(dá)Rluc基因以及遺傳穩(wěn)定性好等特點(diǎn),同時(shí)也可以用于HCoV-OC43對(duì)小鼠的致病性研究,是理想的攜帶報(bào)告基因的HCoV-OC43模型。2、利用重組病毒rOC43-ns2DelRluc篩選HCoV-OC43易感細(xì)胞系研究利用rOC43-ns2DelRluc對(duì)實(shí)驗(yàn)室常見(jiàn)的28種真核細(xì)胞系進(jìn)行了易感性篩選,并利用親本病毒HCoV-OC43-WT進(jìn)行了篩選結(jié)果的驗(yàn)證。結(jié)果發(fā)現(xiàn),有18種細(xì)胞系能夠感染HCoV-OC43,但是HCoV-OC43僅在5種細(xì)胞系中表現(xiàn)出了較強(qiáng)的復(fù)制能力,分別是Huh7.0、293T、BHK-21、RD和CHO細(xì)胞系,并且均在第五天達(dá)到病毒復(fù)制高峰。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果為后續(xù)研究HCoV-OC43的復(fù)制規(guī)律、致病機(jī)制以及篩選抗冠狀病毒宿主基因和藥物提供了參考細(xì)胞系。3、利用重組病毒rOC43-ns2DelRluc篩選宿主抗冠狀病毒基因利用 rOC43-ns2DelRluc 和 RNA 干擾技術(shù)(RNA interference,RNAi)對(duì) 8 個(gè)可能具有抗冠狀病毒作用的宿主基因進(jìn)行了篩選。結(jié)果表明,除了已報(bào)導(dǎo)的TRIM56外,有兩個(gè)宿主因子(DDX3X和PKR)也具有抗病毒作用。其中PKR能夠通過(guò)自身磷酸化在HCoV-OC43感染早期發(fā)揮抗病毒作用,但是這一磷酸化過(guò)程會(huì)隨著GADD34基因的表達(dá)而消失。而DDX3X則是通過(guò)刺激Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生來(lái)發(fā)揮抗HCoV-OC43復(fù)制的功能。進(jìn)一步證明了 rOC43-ns2DelRluc可以作為抗冠狀病毒宿主基因篩選的有效工具。4、利用重組病毒rOC43-ns2DelRluc高通量篩選抗冠狀病毒藥物首先利用已報(bào)導(dǎo)能夠在細(xì)胞水平抑制HCoV-OC43復(fù)制的藥物氯喹(chloroquine)和廣譜抗病毒藥物病毒唑(ribavirin)來(lái)驗(yàn)證rOC43-ns2DelRluc能否用于抗病毒藥物篩選,并在96孔板中對(duì)該重組病毒能否用于高通量抗病毒藥物篩選進(jìn)行了評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示,氯喹在BHK-21細(xì)胞中對(duì)rOC43-ns2DelRluc和HCoV-OC43-WT都有較強(qiáng)的抑制效果,并且隨著氯喹濃度的升高,抑制重組病毒和其親本病毒的動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)一致。此外,Z-factor計(jì)算結(jié)果顯示rOC43-ns2DelRluc可用于抗冠狀病毒藥物高通量篩選。隨后,我們利用rOC43-ns2DelRluc對(duì)藥物庫(kù)進(jìn)行了篩選,并且成功的篩選到了 38個(gè)能夠有效抑制HCoV-OC43復(fù)制的藥物。綜上所述,本研究首次利用反向遺傳學(xué)技術(shù)構(gòu)建了一株能夠穩(wěn)定、高效表達(dá)Rluc報(bào)告基因的重組冠狀病毒rOC43-ns2DelRluc,并利用該重組病毒對(duì)HCoV-OC43易感細(xì)胞系、宿主抗病毒基因和抗病毒藥物進(jìn)行了篩選,為今后篩選抗冠狀病毒宿主基因和藥物提供了有效工具。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R373

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本文編號(hào)：1352853