本文關(guān)鍵詞：二甲雙胍與ABT-263協(xié)同促進p53功能缺陷型腫瘤細胞凋亡的作用及機制研究　出處：《第三軍醫(yī)大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：背景:腫瘤抑癌基因TP53(tumor protein 53)的編碼蛋白p53可以通過促進細胞周期阻滯,誘導細胞凋亡,介導細胞衰老等多種方式發(fā)揮抑癌作用。p53功能在大約半數(shù)的人類腫瘤中都存在障礙,主要原因是由于TP53基因缺失或基因突變(包括顯性失活、雜合性缺失等),在某些腫瘤類型中,p53蛋白也會因過度降解而被廢除正常功能。無論是TP53基因完全缺失,顯性失活,雜合性缺失,或者p53蛋白功能被廢除,都可以導致野生型p53功能喪失,這些可以統(tǒng)稱為p53功能缺陷。臨床前研究表明p53功能缺陷的腫瘤模型對多種抗腫瘤藥物產(chǎn)生化療抵抗,且p53功能缺陷的病人在臨床中的預后普遍較差。盡管在很多實驗模型中,重新活化p53展現(xiàn)出了一定的抑癌效果,但在臨床中針對p53功能缺陷的腫瘤仍然缺少有效的靶向治療措施。這一重要的問題亟待解決。小分子BCL-2抑制劑ABT-263(具有口服活性)及其類似物ABT-737可以特異地靶向BCL-2家族抗凋亡蛋白(BCL-XL和BCL-2等),釋放BCL-2家族促凋亡蛋白活性,進而誘導腫瘤細胞凋亡。在臨床前研究中,ABT-263作為單藥或聯(lián)合其他腫瘤治療藥物均展示了較好的效果。而且在多種類型腫瘤中以ABT-263為基礎的臨床試驗正在開展中且具有潛在的治療前景。目前,ABT-263或ABT-737治療過程中誘導BCL-2家族另一個抗凋亡蛋白MCL-1的水平升高是其主要抵抗因素之一。此外,有研究表明ABT-737單藥對于p53功能缺陷的基因工程鼠的腫瘤發(fā)生發(fā)展只有很小的抑制作用,且p53的功能缺陷嚴重削弱了ABT-737的促凋亡作用。BCL-XL/BCL-2抑制劑ABT-263在p53功能缺陷型腫瘤中的凋亡抵抗機制有待進一步闡明,相應增敏措施也亟待解決。二甲雙胍(metformin)是臨床上廣泛使用的糖尿病治療藥物,近年來其在腫瘤研究中的作用備受關(guān)注。二甲雙胍發(fā)揮抑癌作用的機制之一是通過抑制哺乳動物雷帕霉素靶點復合體1(mTORC1)。有趣的是,p53對于二甲雙胍發(fā)揮抗癌效應的作用是雙向的:有研究報道,p53對于二甲雙胍在乳腺癌細胞中誘導凋亡和衰老等是必須的。而另外的研究報道,二甲雙胍對p53功能缺陷型腫瘤細胞也具有殺傷作用�；谝陨涎芯繄蟮�,探究ABT-263在p53功能缺陷型腫瘤細胞中的凋亡抵抗因素,及二甲雙胍是否可以和ABT-263協(xié)同殺傷p53功能缺陷型腫瘤細胞,是一項新穎而有意義的研究。目的:本研究以p53功能缺陷型及p53野生型腫瘤細胞系為模型,擬通過相關(guān)實驗方法,探討二甲雙胍及ABT-263聯(lián)合使用對其凋亡的誘導作用及相應分子機制。以期為二甲雙胍和ABT-263的抗腫瘤作用提供新的依據(jù),同時為基于聯(lián)合應用二甲雙胍和ABT-263特異性靶向治療p53功能缺陷型腫瘤提供理論基礎。方法:1.在p53功能缺陷型腫瘤細胞系中,使用不同濃度梯度的二甲雙胍及ABT-263組合,通過CCK-8試驗檢測細胞活力,確定最適的聯(lián)用濃度;進而通過流式細胞術(shù),Western blot檢測剪切型PARP等方法分析凋亡,探究在p53功能缺陷型細胞系中二甲雙胍和ABT-263是否具有協(xié)同促凋亡作用;2.通過Western blot篩選可能介導二甲雙胍和ABT-263協(xié)同作用的BCL-2家族及IAPs家族抗凋亡分子,進而分別轉(zhuǎn)染相應的干擾序列或過表達質(zhì)粒,通過模擬和回復實驗證實這些分子所起的作用;3.應用蛋白質(zhì)免疫共沉淀(Co-IP)技術(shù),探究在二甲雙胍和ABT-263的單獨及聯(lián)合作用下,BCL-2家族抗凋亡與促凋亡分子之間的相互作用變化以及IAPs家族分子與CASPASE家族分子之間的相互作用變化;4.應用qRT-PCR技術(shù),探究二甲雙胍及ABT-263單獨或聯(lián)用對MCL-1,XIAP及SURVIVIN等mRNA表達水平的影響;5.應用翻譯抑制劑CHX,探究二甲雙胍及ABT-263單獨或聯(lián)用對MCL-1,XIAP及SURVIVIN等的蛋白水平是否存在翻譯后(即蛋白降解水平)的影響;6.使用Western blot篩選可能介導二甲雙胍和ABT-263協(xié)同促凋亡作用的翻譯相關(guān)信號通路;7.運用Co-IP及7-甲基-GTP帽結(jié)合(m7-GTP cap binding)分析技術(shù),探究二甲雙胍及ABT-263聯(lián)合應用對于cap依賴的蛋白翻譯的作用;8.使用不同的mTOR抑制劑,探索介導二甲雙胍和ABT-263影響cap依賴性翻譯的具體mTOR下游效應分子;9.使用HCT-116的p53野生(HCT-116 p53+/+)及p53缺失(HCT-116 p53-/-)細胞對,分別探索聯(lián)用二甲雙胍及ABT-263在p53功能缺陷和正常的腫瘤細胞中的促凋亡效應,進而應用Western blot分析可能的分子機制;10.運用Co-IP及m7-GTP cap binding分析技術(shù),探索在p53功能正常的情況下二甲雙胍和ABT-263單獨及聯(lián)合應用對cap依賴的翻譯的影響;11.分別運用細胞衰老相關(guān)β半乳糖苷酶染色和qRT-PCR,探索在p53功能缺陷和正常的情況下,二甲雙胍和ABT-263單獨及聯(lián)合應用對于細胞衰老和細胞衰老相關(guān)分泌表型的影響;12.使用在兩種模型中差異表達的促癌炎性細胞因子中和抗體或NF-κB抑制劑,進一步證實細胞衰老相關(guān)分泌因子在介導p53野生型腫瘤細胞抵抗二甲雙胍聯(lián)用ABT-263促凋亡作用中的重要性;13.建立p53野生型及p53功能缺陷型荷瘤鼠模型,單獨或聯(lián)合使用二甲雙胍及ABT-263探究其對相應腫瘤的生長抑制作用,進而使用Western blot解析具體分子機制;結(jié)果:1.二甲雙胍和ABT-263在多種p53功能缺陷型腫瘤細胞中可以顯著協(xié)同促進細胞凋亡;2.二甲雙胍通過下調(diào)ABT-263誘導的MCL-1,XIAP及SURVIVIN增敏ABT-263的促凋亡作用;ABT-263通過抑制BCL-XL從而釋放游離BIM進而增敏二甲雙胍;3.二甲雙胍通過抑制mTORC1的下游效應分子p-4EBP1抑制cap依賴的翻譯,進而下調(diào)ABT-263誘導的MCL-1和SURVIVIN蛋白水平;二甲雙胍同時通過抑制p-EIF4E從而抑制cap非依賴(IRES依賴)的翻譯,進而下調(diào)ABT-263誘導的XIAP蛋白水平;4.在p53野生型腫瘤細胞中,二甲雙胍和ABT-263的聯(lián)合處理異�；罨�4EBP1—MCL-1/SURVIVIN信號通路,使得二者無法協(xié)同促凋亡;5.在p53野生型腫瘤細胞中,p53介導的細胞衰老相關(guān)分泌表型(SASP)異常活化了4EBP1—MCL-1/SURVIVIN通路,導致對二甲雙胍和ABT-263的聯(lián)用治療抵抗;6.在異種移植裸鼠腫瘤模型中,聯(lián)用二甲雙胍和ABT-263協(xié)同抑制p53功能缺陷型(而非p53野生型)腫瘤的生長,其機制與細胞實驗吻合;結(jié)論:在p53功能缺陷型腫瘤細胞中,二甲雙胍與ABT-263可以通過整合凋亡機器和翻譯機器協(xié)同誘導細胞凋亡,抑制腫瘤生長;而在p53野生型腫瘤細胞中,二者無協(xié)同促凋亡作用。本研究為以二甲雙胍和ABT-263聯(lián)合應用特異性靶向治療p53功能缺陷型腫瘤提供了新的科學依據(jù)。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R73-36

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本文編號：1352497