本文關(guān)鍵詞：二甲雙胍與ABT-263協(xié)同促進(jìn)p53功能缺陷型腫瘤細(xì)胞凋亡的作用及機(jī)制研究　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2017年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

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【摘要】：背景:腫瘤抑癌基因TP53(tumor protein 53)的編碼蛋白p53可以通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞周期阻滯,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,介導(dǎo)細(xì)胞衰老等多種方式發(fā)揮抑癌作用。p53功能在大約半數(shù)的人類(lèi)腫瘤中都存在障礙,主要原因是由于TP53基因缺失或基因突變(包括顯性失活、雜合性缺失等),在某些腫瘤類(lèi)型中,p53蛋白也會(huì)因過(guò)度降解而被廢除正常功能。無(wú)論是TP53基因完全缺失,顯性失活,雜合性缺失,或者p53蛋白功能被廢除,都可以導(dǎo)致野生型p53功能喪失,這些可以統(tǒng)稱(chēng)為p53功能缺陷。臨床前研究表明p53功能缺陷的腫瘤模型對(duì)多種抗腫瘤藥物產(chǎn)生化療抵抗,且p53功能缺陷的病人在臨床中的預(yù)后普遍較差。盡管在很多實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?重新活化p53展現(xiàn)出了一定的抑癌效果,但在臨床中針對(duì)p53功能缺陷的腫瘤仍然缺少有效的靶向治療措施。這一重要的問(wèn)題亟待解決。小分子BCL-2抑制劑ABT-263(具有口服活性)及其類(lèi)似物ABT-737可以特異地靶向BCL-2家族抗凋亡蛋白(BCL-XL和BCL-2等),釋放BCL-2家族促凋亡蛋白活性,進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。在臨床前研究中,ABT-263作為單藥或聯(lián)合其他腫瘤治療藥物均展示了較好的效果。而且在多種類(lèi)型腫瘤中以ABT-263為基礎(chǔ)的臨床試驗(yàn)正在開(kāi)展中且具有潛在的治療前景。目前,ABT-263或ABT-737治療過(guò)程中誘導(dǎo)BCL-2家族另一個(gè)抗凋亡蛋白MCL-1的水平升高是其主要抵抗因素之一。此外,有研究表明ABT-737單藥對(duì)于p53功能缺陷的基因工程鼠的腫瘤發(fā)生發(fā)展只有很小的抑制作用,且p53的功能缺陷嚴(yán)重削弱了ABT-737的促凋亡作用。BCL-XL/BCL-2抑制劑ABT-263在p53功能缺陷型腫瘤中的凋亡抵抗機(jī)制有待進(jìn)一步闡明,相應(yīng)增敏措施也亟待解決。二甲雙胍(metformin)是臨床上廣泛使用的糖尿病治療藥物,近年來(lái)其在腫瘤研究中的作用備受關(guān)注。二甲雙胍發(fā)揮抑癌作用的機(jī)制之一是通過(guò)抑制哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶點(diǎn)復(fù)合體1(mTORC1)。有趣的是,p53對(duì)于二甲雙胍發(fā)揮抗癌效應(yīng)的作用是雙向的:有研究報(bào)道,p53對(duì)于二甲雙胍在乳腺癌細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡和衰老等是必須的。而另外的研究報(bào)道,二甲雙胍對(duì)p53功能缺陷型腫瘤細(xì)胞也具有殺傷作用�；谝陨涎芯繄�(bào)道,探究ABT-263在p53功能缺陷型腫瘤細(xì)胞中的凋亡抵抗因素,及二甲雙胍是否可以和ABT-263協(xié)同殺傷p53功能缺陷型腫瘤細(xì)胞,是一項(xiàng)新穎而有意義的研究。目的:本研究以p53功能缺陷型及p53野生型腫瘤細(xì)胞系為模型,擬通過(guò)相關(guān)實(shí)驗(yàn)方法,探討二甲雙胍及ABT-263聯(lián)合使用對(duì)其凋亡的誘導(dǎo)作用及相應(yīng)分子機(jī)制。以期為二甲雙胍和ABT-263的抗腫瘤作用提供新的依據(jù),同時(shí)為基于聯(lián)合應(yīng)用二甲雙胍和ABT-263特異性靶向治療p53功能缺陷型腫瘤提供理論基礎(chǔ)。方法:1.在p53功能缺陷型腫瘤細(xì)胞系中,使用不同濃度梯度的二甲雙胍及ABT-263組合,通過(guò)CCK-8試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力,確定最適的聯(lián)用濃度;進(jìn)而通過(guò)流式細(xì)胞術(shù),Western blot檢測(cè)剪切型PARP等方法分析凋亡,探究在p53功能缺陷型細(xì)胞系中二甲雙胍和ABT-263是否具有協(xié)同促凋亡作用;2.通過(guò)Western blot篩選可能介導(dǎo)二甲雙胍和ABT-263協(xié)同作用的BCL-2家族及IAPs家族抗凋亡分子,進(jìn)而分別轉(zhuǎn)染相應(yīng)的干擾序列或過(guò)表達(dá)質(zhì)粒,通過(guò)模擬和回復(fù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)這些分子所起的作用;3.應(yīng)用蛋白質(zhì)免疫共沉淀(Co-IP)技術(shù),探究在二甲雙胍和ABT-263的單獨(dú)及聯(lián)合作用下,BCL-2家族抗凋亡與促凋亡分子之間的相互作用變化以及IAPs家族分子與CASPASE家族分子之間的相互作用變化;4.應(yīng)用qRT-PCR技術(shù),探究二甲雙胍及ABT-263單獨(dú)或聯(lián)用對(duì)MCL-1,XIAP及SURVIVIN等mRNA表達(dá)水平的影響;5.應(yīng)用翻譯抑制劑CHX,探究二甲雙胍及ABT-263單獨(dú)或聯(lián)用對(duì)MCL-1,XIAP及SURVIVIN等的蛋白水平是否存在翻譯后(即蛋白降解水平)的影響;6.使用Western blot篩選可能介導(dǎo)二甲雙胍和ABT-263協(xié)同促凋亡作用的翻譯相關(guān)信號(hào)通路;7.運(yùn)用Co-IP及7-甲基-GTP帽結(jié)合(m7-GTP cap binding)分析技術(shù),探究二甲雙胍及ABT-263聯(lián)合應(yīng)用對(duì)于cap依賴(lài)的蛋白翻譯的作用;8.使用不同的mTOR抑制劑,探索介導(dǎo)二甲雙胍和ABT-263影響cap依賴(lài)性翻譯的具體mTOR下游效應(yīng)分子;9.使用HCT-116的p53野生(HCT-116 p53+/+)及p53缺失(HCT-116 p53-/-)細(xì)胞對(duì),分別探索聯(lián)用二甲雙胍及ABT-263在p53功能缺陷和正常的腫瘤細(xì)胞中的促凋亡效應(yīng),進(jìn)而應(yīng)用Western blot分析可能的分子機(jī)制;10.運(yùn)用Co-IP及m7-GTP cap binding分析技術(shù),探索在p53功能正常的情況下二甲雙胍和ABT-263單獨(dú)及聯(lián)合應(yīng)用對(duì)cap依賴(lài)的翻譯的影響;11.分別運(yùn)用細(xì)胞衰老相關(guān)β半乳糖苷酶染色和qRT-PCR,探索在p53功能缺陷和正常的情況下,二甲雙胍和ABT-263單獨(dú)及聯(lián)合應(yīng)用對(duì)于細(xì)胞衰老和細(xì)胞衰老相關(guān)分泌表型的影響;12.使用在兩種模型中差異表達(dá)的促癌炎性細(xì)胞因子中和抗體或NF-κB抑制劑,進(jìn)一步證實(shí)細(xì)胞衰老相關(guān)分泌因子在介導(dǎo)p53野生型腫瘤細(xì)胞抵抗二甲雙胍聯(lián)用ABT-263促凋亡作用中的重要性;13.建立p53野生型及p53功能缺陷型荷瘤鼠模型,單獨(dú)或聯(lián)合使用二甲雙胍及ABT-263探究其對(duì)相應(yīng)腫瘤的生長(zhǎng)抑制作用,進(jìn)而使用Western blot解析具體分子機(jī)制;結(jié)果:1.二甲雙胍和ABT-263在多種p53功能缺陷型腫瘤細(xì)胞中可以顯著協(xié)同促進(jìn)細(xì)胞凋亡;2.二甲雙胍通過(guò)下調(diào)ABT-263誘導(dǎo)的MCL-1,XIAP及SURVIVIN增敏ABT-263的促凋亡作用;ABT-263通過(guò)抑制BCL-XL從而釋放游離BIM進(jìn)而增敏二甲雙胍;3.二甲雙胍通過(guò)抑制mTORC1的下游效應(yīng)分子p-4EBP1抑制cap依賴(lài)的翻譯,進(jìn)而下調(diào)ABT-263誘導(dǎo)的MCL-1和SURVIVIN蛋白水平;二甲雙胍同時(shí)通過(guò)抑制p-EIF4E從而抑制cap非依賴(lài)(IRES依賴(lài))的翻譯,進(jìn)而下調(diào)ABT-263誘導(dǎo)的XIAP蛋白水平;4.在p53野生型腫瘤細(xì)胞中,二甲雙胍和ABT-263的聯(lián)合處理異�；罨�4EBP1—MCL-1/SURVIVIN信號(hào)通路,使得二者無(wú)法協(xié)同促凋亡;5.在p53野生型腫瘤細(xì)胞中,p53介導(dǎo)的細(xì)胞衰老相關(guān)分泌表型(SASP)異�；罨�4EBP1—MCL-1/SURVIVIN通路,導(dǎo)致對(duì)二甲雙胍和ABT-263的聯(lián)用治療抵抗;6.在異種移植裸鼠腫瘤模型中,聯(lián)用二甲雙胍和ABT-263協(xié)同抑制p53功能缺陷型(而非p53野生型)腫瘤的生長(zhǎng),其機(jī)制與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)吻合;結(jié)論:在p53功能缺陷型腫瘤細(xì)胞中,二甲雙胍與ABT-263可以通過(guò)整合凋亡機(jī)器和翻譯機(jī)器協(xié)同誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,抑制腫瘤生長(zhǎng);而在p53野生型腫瘤細(xì)胞中,二者無(wú)協(xié)同促凋亡作用。本研究為以二甲雙胍和ABT-263聯(lián)合應(yīng)用特異性靶向治療p53功能缺陷型腫瘤提供了新的科學(xué)依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R73-36

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本文編號(hào)：1352497