本文關(guān)鍵詞：細(xì)胞自噬對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞功能影響的機(jī)制研究　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2017年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 內(nèi)皮祖細(xì)胞 自噬 氧化型低密度脂蛋白 鈣庫(kù)操縱性鈣內(nèi)流 鈣調(diào)蛋白激酶激酶 雷帕霉素靶標(biāo) 匹伐他汀

【摘要】：研究背景及目的目前研究認(rèn)為,血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷和功能異常是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的始動(dòng)環(huán)節(jié),受損內(nèi)皮細(xì)胞的修復(fù)對(duì)于動(dòng)脈粥樣硬化病變的發(fā)生和發(fā)展至關(guān)重要。內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells,EPCs)作為血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞,是受損內(nèi)皮修復(fù)的主要參與者。EPCs主要存儲(chǔ)于骨髓、脾臟等器官,在生理或病理因素刺激下,EPCs從骨髓、脾臟等動(dòng)員,遷移到外周血并歸巢至損傷血管附近,參與受損內(nèi)皮的修復(fù)。然而,傳統(tǒng)方式以EPCs移植為基礎(chǔ)的細(xì)胞治療,由于受循環(huán)中多種心血管危險(xiǎn)因素的影響,移植后的EPCs生物學(xué)功能受到損害,增殖能力降低,生存能力減弱,局限了細(xì)胞治療向臨床的轉(zhuǎn)化。因此,尋求提高應(yīng)激條件下EPCs的生存能力,促進(jìn)EPCs增殖,改善受損內(nèi)皮的修復(fù),對(duì)有效防治動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病具有重要意義。自噬(autophagy)是真核細(xì)胞特有的降解長(zhǎng)壽命蛋白和受損細(xì)胞器的主要途徑,也是細(xì)胞適應(yīng)不利環(huán)境,維持穩(wěn)態(tài),促進(jìn)生存的重要方式。細(xì)胞自噬受多種因素的影響,目前研究認(rèn)為細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)的失衡是影響自噬水平的重要因素;然而由于胞內(nèi)外鈣信號(hào)的復(fù)雜變化,鈣離子對(duì)細(xì)胞自噬調(diào)控的信號(hào)通路及自噬水平的變化趨勢(shì)尚存爭(zhēng)議。EPCs作為非興奮細(xì)胞,鈣庫(kù)操縱性鈣內(nèi)流(store operated calcium entry,SOCE)是其主要鈣內(nèi)流的方式,由鈣庫(kù)操縱性鈣通道(store operated calcium channels,SOCC)復(fù)合體介導(dǎo)。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn),EPCs上不僅普遍表達(dá)SOCC復(fù)合體組成蛋白STIM1、TRPC1和ORAI1,并且與EPCs的眾多生物學(xué)功能密切相關(guān)。因此,這提示我們SOCC復(fù)合體介導(dǎo)的鈣內(nèi)流可能參與了EPCs自噬水平的調(diào)控,而通過(guò)對(duì)EPCs自噬水平的調(diào)節(jié)將有助于增強(qiáng)EPCs在應(yīng)激條件下的生存能力,提高移植后循環(huán)中EPCs的生存效率,進(jìn)一步改善受損內(nèi)皮的修復(fù)�；谝陨显�,本研究利用動(dòng)脈粥樣硬化模型小鼠及體外模擬動(dòng)脈粥樣硬化危險(xiǎn)因素-氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,ox-LDL),探討SOCE介導(dǎo)的細(xì)胞自噬在EPCs生物學(xué)功能中的作用及機(jī)制,尋求提高細(xì)胞自噬的臨床藥物,為提高EPCs移植效率提供理論基礎(chǔ)和依據(jù)。方法1.動(dòng)脈粥樣硬化模型小鼠EPCs增殖、遷移能力及和自噬水平的變化1.1動(dòng)脈粥樣硬化模型小鼠建立及EPCs的培養(yǎng)、鑒定Apo E-/-小鼠飼以高脂飲食(21%脂肪、0.15%膽固醇),分別于12周和16周收獲動(dòng)脈粥樣硬化模型小鼠,取小鼠主動(dòng)脈進(jìn)行油紅O染色驗(yàn)證動(dòng)脈粥樣硬化模型。野生型小鼠采用Apo E-/-同源的C57BL/6小鼠作為對(duì)照。通過(guò)密度梯度離心方法分離獲得小鼠骨髓源性EPCs,培養(yǎng)在人纖連蛋白鋪板后的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中。1.2流式細(xì)胞儀及熒光多標(biāo)方法鑒定EPCs。1.2.1分別用PE標(biāo)記抗小鼠CD133抗體、Per CP標(biāo)記抗小鼠的CD34抗體,APC標(biāo)記抗小鼠的VEGFR-2抗體避光孵育1小時(shí),以同型抗體為對(duì)照,孵育后的細(xì)胞用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面VEGFR-2、CD34、CD133抗原的表達(dá);1.2.2采用FITC-UEA-I、Di I-ac LDL和DAPI分別對(duì)分離后的細(xì)胞染色后,采用激光共聚焦顯微鏡觀察,顯示綠色熒光的為UEA-I陽(yáng)性細(xì)胞,紅色熒光的為Di I-ac LDL陽(yáng)性細(xì)胞,藍(lán)色熒光則是細(xì)胞核,三染陽(yáng)性細(xì)胞為正在分化的EPCs。1.3動(dòng)脈粥樣硬化模型小鼠EPCs增殖和遷移功能的變化1.3.1采用顯微鏡下計(jì)數(shù)和CCK-8檢測(cè)分析EPCs增殖能力。1.3.2利用遷移小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)EPCs遷移能力的變化。1.4動(dòng)脈粥樣硬化模型小鼠EPCs的自噬水平的變化1.4.1分離培養(yǎng)7天后的EPCs,以Western Blot分析各組自噬標(biāo)志蛋白LC3II/LC3I、p62的表達(dá)變化。1.4.2向分離培養(yǎng)7天后的EPCs轉(zhuǎn)染GFP-m RFP-LC3腺病毒標(biāo)記LC3約4小時(shí),激光共聚焦下觀察并計(jì)數(shù)各組自噬體與自噬溶酶體的數(shù)量,評(píng)價(jià)細(xì)胞自噬水平。2.ox-LDL對(duì)大鼠EPCs增殖、遷移能力,SOCE及細(xì)胞自噬水平的影響2.1流式細(xì)胞儀及熒光多標(biāo)方法鑒定。2.1.1分別用PE標(biāo)記抗大鼠CD133抗體、Per CP標(biāo)記抗大鼠的CD34抗體,APC標(biāo)記抗大鼠的VEGFR-2抗體避光孵育1小時(shí),以同型抗體為對(duì)照,孵育后的細(xì)胞用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面VEGFR-2、CD34、CD133抗原的表達(dá);2.1.2采用FITC-UEA-I、Di I-ac LDL和DAPI分別對(duì)分離后的細(xì)胞染色后,采用激光共聚焦顯微鏡觀察,顯示綠色熒光的為UEA-I陽(yáng)性細(xì)胞,紅色熒光的為Di I-ac LDL陽(yáng)性細(xì)胞,藍(lán)色熒光則是細(xì)胞核,三染陽(yáng)性細(xì)胞為正在分化的EPCs。2.2.1分離獲得正常大鼠EPCs,體外培養(yǎng)7天后,我們采用不同濃度ox-LDL培養(yǎng)6、12和24小時(shí)后,通過(guò)CCK-8檢測(cè)EPCs增殖能力。2.2.2 CCK-8檢測(cè)分析EPCs增殖能力。2.2.3遷移小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)EPCs遷移能力的變化。2.3 ox-LDL對(duì)EPCs的SOCE的影響2.3.1分離獲得正常大鼠EPCs,暴露于含有0-100μg/ml ox-LDL培養(yǎng)基中12小時(shí),再孵育鈣離子探針Fluo3-AM,并在激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光強(qiáng)度,通過(guò)公式計(jì)算胞內(nèi)鈣濃度。[Ca2+]i(n M)= Kd ×(F-Fmin)/(Fmax-F)(Kd:室溫下解離常數(shù))2.3.2分離獲得正常大鼠EPCs,孵育鈣離子探針Fluo3-AM,并在激光共聚焦顯微鏡下觀察不同濃度ox-LDL瞬時(shí)刺激EPCs后,細(xì)胞內(nèi)鈣流的變化;5分鐘后再向無(wú)鈣的細(xì)胞外液中加入2 m M鈣離子,共聚焦顯微鏡下進(jìn)一步動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞內(nèi)鈣流變化。2.3.3 Western Blot檢測(cè)ox-LDL暴露后EPCs內(nèi)SOCC組成蛋白STIM1的表達(dá)變化。2.3.4分離獲得正常大鼠EPCs,利用慢病毒沉默STIM1后,暴露于60μg/ml ox-LDL培養(yǎng)基中12小時(shí),再孵育鈣離子探針Fluo3-AM,并在激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光強(qiáng)度,通過(guò)公式計(jì)算胞內(nèi)鈣濃度。2.3.5分離獲得正常大鼠EPCs,慢病毒轉(zhuǎn)染的方式穩(wěn)定沉默SOCC復(fù)合體關(guān)鍵蛋白STIM1,2天后再孵育鈣離子探針Fluo-3-AM,在激光共聚焦顯微鏡下,觀察60μg/ml ox-LDL瞬時(shí)刺激EPCs后,細(xì)胞內(nèi)鈣流的變化;5分鐘后再向無(wú)鈣的細(xì)胞外液中加入2 m M鈣離子,共聚焦顯微鏡下進(jìn)一步動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞內(nèi)鈣流的變化。2.3.6分離獲得正常大鼠EPCs,孵育鈣離子探針Fluo3-AM,在激光共聚焦顯微鏡下,動(dòng)態(tài)觀察60μg/ml ox-LDL瞬時(shí)刺激EPCs后,細(xì)胞內(nèi)鈣流的變化;5分鐘后再向無(wú)鈣的細(xì)胞外液中加入2 m M鈣離子,30秒后再加入50μM SOCE特異性抑制劑2-APB,共聚焦顯微鏡下進(jìn)一步動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞內(nèi)鈣流的變化。2.4 ox-LDL對(duì)EPCs自噬水平影響2.4.1分離獲得正常大鼠EPCs,用不同濃度ox-LDL培養(yǎng)EPCs 6、12、18和24小時(shí)后,提取蛋白后分別行Western Blot檢測(cè)自噬標(biāo)志蛋白LC3II/LC3I和p62表達(dá)水平。2.4.2 60μg/ml ox-LDL培養(yǎng)EPCs 12小時(shí)后轉(zhuǎn)染GFP-m RFP-LC3腺病毒標(biāo)記LC3約4小時(shí),激光共聚焦下觀察并計(jì)數(shù)各組自噬體與自噬溶酶體的數(shù)量,評(píng)價(jià)細(xì)胞自噬2.2 ox-LDL對(duì)EPCs增殖、遷移能力的影響水平。3.SOCE-CAMKK2-MTOR介導(dǎo)的細(xì)胞自噬與EPCs功能的關(guān)系3.1 ox-LDL激活SOCE-CAMKK2-MTOR信號(hào)通路促進(jìn)EPCs自噬的發(fā)生3.1.1分離培養(yǎng)7天后的EPCs,分別用BAPTA-AM 20μM或EGTA 10 m M預(yù)處理20分鐘后,再暴露于60μg/ml ox-LDL 12小時(shí),Western Blots檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)LC3II/LC3I的表達(dá)。3.1.2分離培養(yǎng)7天后的EPCs,分別用細(xì)胞內(nèi)鈣離子螯合劑BAPTA-AM和細(xì)胞外鈣離子螯合劑EGTA處理20分鐘,再暴露于60μg/ml ox-LDL 12小時(shí),然后再轉(zhuǎn)染GFP-m RFP-LC3腺病毒標(biāo)記LC3約4小時(shí),激光共聚焦下觀察并計(jì)數(shù)各組自噬體與自噬溶酶體的數(shù)量,評(píng)價(jià)細(xì)胞自噬水平。3.1.3分離培養(yǎng)7天后的EPCs暴露于60μg/ml ox-LDL 12小時(shí)后,提取總蛋白Western Blot分別檢測(cè)p-CAMKK2、CAMKK2、p-AMPK、AMPK、p-MTOR、MTOR、p-P70S6K和P70S6K蛋白表達(dá)情況。3.1.4利用CAMKK2特異性抑制劑STO-609預(yù)處理后的EPCs,再將EPCs暴露于60μg/ml ox-LDL 12小時(shí)后,Western Blots檢測(cè)LC3II/LC3I、p-CAMKK2、CAMKK2、p-AMPK、AMPK、p-MTOR、MTOR、p-P70S6K和P70S6K的表達(dá)。3.1.5構(gòu)建STIM1沉默慢病毒,轉(zhuǎn)染培養(yǎng)5天的EPCs,抑制STIM1表達(dá),再將EPCs暴露于含有60μg/ml ox-LDL培養(yǎng)基中12小時(shí),Western Blot檢測(cè)LC3II/LC3I、p-CAMKK2和CAMKK2的表達(dá)。3.2細(xì)胞自噬與EPCs功能的關(guān)系3.2.1分離培養(yǎng)后的EPCs接種于E-plates培養(yǎng)板上,24小時(shí)后轉(zhuǎn)染慢病毒沉默自噬關(guān)鍵蛋白ATG7,轉(zhuǎn)染48小時(shí)后再將EPCs暴露于含有60μg/ml ox-LDL的培養(yǎng)基中,細(xì)胞實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)分析記錄儀(Real-time cellular analyzer,RTCA)動(dòng)態(tài)記錄自噬抑制后EPCs增殖能力。3.2.2分離培養(yǎng)5天后的EPCs轉(zhuǎn)染慢病毒沉默自噬關(guān)鍵蛋白ATG7,48小時(shí)后暴露于含有60μg/ml ox-LDL培養(yǎng)基中,CCK-8分析細(xì)胞增殖能力。3.2.3分離培養(yǎng)5天后的EPCs轉(zhuǎn)染慢病毒沉默自噬關(guān)鍵蛋白ATG7,48小時(shí)后暴露于含有60μg/ml ox-LDL培養(yǎng)基中,Transwell分析細(xì)胞遷移能力。3.2.4分離培養(yǎng)后的EPCs接種于E-plates培養(yǎng)板上,利用自噬特異性抑制劑3-MA處理細(xì)胞后再暴露于含有60μg/ml ox-LDL培養(yǎng)基中,RTCA動(dòng)態(tài)記錄自噬抑制后EPCs增殖能力。3.2.5使用自噬特異性抑制劑3-MA預(yù)處理培養(yǎng)7天后的EPCs,再暴露于含有60μg/ml ox-LDL培養(yǎng)基中12小時(shí),CCK-8分析細(xì)胞增殖能力。3.2.6使用自噬特異性抑制劑3-MA預(yù)處理培養(yǎng)7天后的EPCs,再暴露于含有60μg/ml ox-LDL培養(yǎng)基中12小時(shí),Transwell分析細(xì)胞遷移能力。4.匹伐他汀通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬影響EPCs功能4.1 PTV對(duì)EPCs增殖、遷移能力的影響4.1.1分離培養(yǎng)7天后的EPCs,在含有0.1μM PTV的培養(yǎng)基中培養(yǎng),采用CCK-8分析細(xì)胞增殖能力的變化。4.1.2分離培養(yǎng)7天后的EPCs,在含有0.1μM PTV的培養(yǎng)基中培養(yǎng),采用遷移小室實(shí)驗(yàn)分析細(xì)胞遷移能力的變化。4.2 PTV對(duì)EPCs自噬水平的影響4.2.1在含有0.1μM PTV的培養(yǎng)基中培養(yǎng)后,Western Blot檢測(cè)自噬關(guān)鍵蛋白LC3II/LC3I和p62表達(dá)差異。4.2.2在含有0.1μM PTV的培養(yǎng)基中培養(yǎng)后的EPCs,使用GFP-m RFP-LC3腺病毒轉(zhuǎn)染標(biāo)記后,在激光共聚焦顯微鏡下觀察自噬體與自噬溶酶體的變化。4.3 PTV通過(guò)激活自噬改善EPCs增殖、遷移能力4.3.1利用自噬特異性抑制劑3-MA預(yù)處理后,再暴露于含有0.1μM PTV的培養(yǎng)基中,CCK-8分析細(xì)胞增殖能力的變化。4.3.2利用自噬特異性抑制劑3-MA預(yù)處理后,再暴露于含有0.1μM PTV的培養(yǎng)基中,遷移小室實(shí)驗(yàn)觀察EPCs遷移能力的變化。4.3.3使用慢病毒轉(zhuǎn)染的方式沉默自噬關(guān)鍵蛋白ATG7,48小時(shí)后再暴露于含有0.1μM PTV的培養(yǎng)基中,CCK-8分析細(xì)胞增殖能力的變化。4.3.4使用慢病毒轉(zhuǎn)染的方式沉默自噬關(guān)鍵蛋白ATG7,48小時(shí)后再暴露于含有0.1μM PTV的培養(yǎng)基中,遷移小室實(shí)驗(yàn)觀察EPCs遷移能力的變化。結(jié)果1.動(dòng)脈粥樣硬化模型小鼠EPCs增殖、遷移能力及自噬水平的變化1.1動(dòng)脈粥樣硬化模型小鼠建立及EPCs的培養(yǎng)、鑒定成功構(gòu)建動(dòng)脈粥樣硬化小鼠模型,在小鼠主動(dòng)脈處可見(jiàn)明顯的脂質(zhì)斑塊的形成。成功分離、培養(yǎng)及鑒定EPCs,分離第1日細(xì)胞可見(jiàn)呈圓形的貼壁狀態(tài),第三日可見(jiàn)細(xì)胞呈鋪路石樣改變,第五日可見(jiàn)細(xì)胞呈梭形、紡錘形改變,并呈線樣排列。流式細(xì)胞儀分析后顯示大部分細(xì)胞為VEGFR2、CD133、CD34陽(yáng)性細(xì)胞。熒光染色后顯示大部分細(xì)胞同時(shí)表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)記物(UEA)并具有結(jié)合LDL的能力。1.2動(dòng)脈粥樣硬化模型小鼠EPCs增殖和遷移功能的變化利用CCK-8分析動(dòng)脈粥樣硬化模型小鼠EPCs增殖活性,可見(jiàn)高脂飲食12周后EPCs增殖能力顯著降低,高脂飲食16周后EPCs增殖能力進(jìn)一步降低。Transwell結(jié)果提示高脂飲食12周后EPCs遷移能力降低,高脂飲食16周后進(jìn)一步降低。1.3動(dòng)脈粥樣硬化模型小鼠EPCs的自噬水平的變化分離培養(yǎng)動(dòng)脈粥樣硬化模型小鼠EPCs 7天后,檢測(cè)胞內(nèi)自噬關(guān)鍵蛋白表達(dá),可見(jiàn)隨著動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展LC3II/LC3I表達(dá)比例降低,p62表達(dá)增加,激光共聚焦顯微鏡下自噬體和自噬溶酶體的數(shù)量減少。2.ox-LDL對(duì)EPCs增殖、遷移能力,SOCE及細(xì)胞自噬水平的影響2.1在觀察到動(dòng)脈粥樣硬化模型小鼠EPCs生物學(xué)功能和自噬水平的改變后,我們采用動(dòng)脈粥樣硬化危險(xiǎn)因素ox-LDL體外模擬動(dòng)脈粥樣硬化形成微環(huán)境。通過(guò)CCK-8分析我們發(fā)現(xiàn)ox-LDL呈劑量和時(shí)間依賴(lài)性降低EPCs增殖能力。在遷移小室實(shí)驗(yàn)中,ox-LDL同樣顯著降低EPCs遷移能力。2.2在檢測(cè)到ox-LDL對(duì)EPCs增殖、遷移能力的影響之后,我們檢測(cè)EPCs內(nèi)鈣濃度,發(fā)現(xiàn)ox-LDL處理后,EPCs內(nèi)鈣濃度顯著增加,ox-LDL是否通過(guò)SOCE引起胞內(nèi)鈣濃度變化的,我們進(jìn)一步在激光共聚焦下觀察到ox-LDL瞬時(shí)刺激EPCs后引起了胞內(nèi)鈣庫(kù)的釋放,5分鐘后再向無(wú)鈣的細(xì)胞外液中加入2 m M鈣離子,進(jìn)一步引起了胞內(nèi)鈣濃度的增加,胞內(nèi)鈣的再次增加是通過(guò)SOCE介導(dǎo),并呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性。我們根據(jù)公式計(jì)算得到細(xì)胞內(nèi)實(shí)際鈣離子濃度,我們證實(shí)ox-LDL激活SOCE引起EPCs內(nèi)鈣水平增加。此外,STIM1作為SOCC重要組成蛋白,STIM1是否參與ox-LDL誘導(dǎo)的SOCE,我們檢測(cè)ox-LDL處理后STIM1表達(dá),發(fā)現(xiàn)60和100μg/ml ox-LDL暴露12小時(shí)后顯著增強(qiáng)STIM1表達(dá)。2.3根據(jù)以上結(jié)果我們確定60μg/ml為后續(xù)實(shí)驗(yàn)組ox-LDL濃度,我們采用慢病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的方式沉默SOCC復(fù)合體關(guān)鍵蛋白STIM1,隨后再用60μg/ml ox-LDL瞬時(shí)刺激EPCs,在共聚焦顯微鏡下可見(jiàn)在STIM1沉默組ox-LDL引起胞內(nèi)鈣庫(kù)釋放的鈣振幅顯著減弱,同時(shí)在細(xì)胞外液中補(bǔ)充2 m M濃度的鈣離子后,STIM1沉默組的SOCE振幅依然顯著低于對(duì)照組。我們?cè)谘a(bǔ)充外液鈣離子前30秒用SOCE特異性抑制劑50μM 2-APB預(yù)處理細(xì)胞,結(jié)果顯示2-APB組能夠顯著抑制ox-LDL引起的SOCE,進(jìn)一步證實(shí)ox-LDL激活SOCE。2.4隨后我們檢測(cè)ox-LDL對(duì)EPCs自噬水平的影響,發(fā)現(xiàn)ox-LDL呈劑量-時(shí)間依賴(lài)性顯著增加EPCs內(nèi)LC3II/LC3I比例,結(jié)果顯示ox-LDL增強(qiáng)EPCs自噬水平。結(jié)合自噬體和溶酶體特異性阻斷劑BAFA1和CQ,我們?cè)诩す夤簿劢癸@微鏡下發(fā)現(xiàn)ox-LDL促進(jìn)EPCs自噬流。3.SOCE-CAMKK2-MTOR介導(dǎo)的細(xì)胞自噬與EPCs功能的關(guān)系3.1細(xì)胞內(nèi)鈣離子螯合劑(BAPTA-AM)和細(xì)胞外鈣離子螯合劑(EGTA)預(yù)處理后顯著逆轉(zhuǎn)ox-LDL引起的LC3II/LC3I增加(p0.01),同時(shí)共聚焦顯微鏡下也顯示細(xì)胞內(nèi)外鈣離子螯合劑預(yù)處理后,減少了ox-LDL引起的自噬體和自噬溶酶體的增加(p0.01)。3.2隨后我們探究ox-LDL是如何激活EPCs自噬的,發(fā)現(xiàn)60μg/ml ox-LDL處理EPCs 12小時(shí)后,增加了CAMKK2(p0.01)和AMPK(p0.01)磷酸化水平,降低了MTOR(p0.01)和P70S6K(p0.01)的磷酸化水平。采用CAMKK2特異性抑制劑預(yù)處理后,在顯著降低ox-LDL引起的LC3II/LC3I(p0.01)比例的同時(shí),逆轉(zhuǎn)了ox-LDL對(duì)AMPK(p0.01)磷酸化,增加了MTOR(p0.01)和P70S6K(p0.01)的磷酸化。此外,通過(guò)慢病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染沉默STIM1后,ox-LDL上調(diào)的LC3II/LC3I和CAMKK2磷酸化被逆轉(zhuǎn)。以上結(jié)果證實(shí),ox-LDL通過(guò)SOCE-CAMKK2-MTOR通路激活EPCs自噬。3.3為進(jìn)一步探究自噬與EPCs功能的關(guān)系,我們發(fā)現(xiàn)沉默EPCs自噬后,RTCA和CCK-8結(jié)果顯示ox-LDL進(jìn)一步抑制EPCs增殖能力(p0.01);此外,采用自噬抑制劑3-MA預(yù)處理后再暴露于ox-LDL,EPCs增殖能力也進(jìn)一步抑制(p0.01)。該結(jié)果證實(shí)ox-LDL激活的自噬保護(hù)應(yīng)激環(huán)境下EPCs增殖能力。4.匹伐他汀通過(guò)調(diào)節(jié)自噬影響EPCs功能我們?cè)趯で筇岣逧PCs功能的藥物中發(fā)現(xiàn),匹伐他汀(Pitavastatin,PTV)顯著提高EPCs增殖和遷移能力的同時(shí)上調(diào)了自噬關(guān)鍵蛋白LC3II/LC3I的比例,降低了p62的表達(dá),激活了EPCs自噬。當(dāng)我們采用慢病毒沉默自噬后,PTV改善EPCs增殖和遷移能力被逆轉(zhuǎn);此外,自噬抑制劑3-MA預(yù)處理EPCs后,PTV改善EPCs增殖和遷移的能力同樣被逆轉(zhuǎn)。以上結(jié)果證明,PTV通過(guò)增強(qiáng)EPCs自噬的方式改善EPCs功能。結(jié)論1.動(dòng)脈粥樣硬化模型小鼠中EPCs增殖、遷移能力減弱,自噬水平降低;2.體外ox-LDL模擬動(dòng)脈粥樣硬化形成微環(huán)境,EPCs增殖、能力減弱,SOCE被激活,自噬水平增強(qiáng);3.體外ox-LDL培養(yǎng)EPCs,激活SOCE-CAMKK2-MTOR信號(hào)通路上調(diào)EPCs自噬水平,自噬的激活保護(hù)應(yīng)激環(huán)境下EPCs增殖、遷移能力;4.PTV通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬水平,改善EPCs生物學(xué)功能。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R543.5

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 章晟;于長(zhǎng)明;殷瑛;陳薇;;細(xì)胞自噬在病原體感染過(guò)程中的作用研究進(jìn)展[J];軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊;2009年05期

2 邢國(guó)勝;賀桂泉;趙文君;;藥物對(duì)細(xì)胞自噬性死亡的干預(yù)作用[J];天津藥學(xué);2011年03期

3 ;《現(xiàn)代細(xì)胞自噬分子生物學(xué)》出版[J];診斷學(xué)理論與實(shí)踐;2011年05期

4 ;《現(xiàn)代細(xì)胞自噬分子生物學(xué)》出版[J];診斷學(xué)理論與實(shí)踐;2011年06期

5 陳蘭芳;肖亮;楊軍平;;細(xì)胞自噬的分子機(jī)制及其功能[J];實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué);2014年02期

6 李桂蘭;閆華超;;細(xì)胞自噬對(duì)衰老的調(diào)節(jié)[J];中國(guó)老年學(xué)雜志;2010年09期

7 王琦;蘇舒;王立新;;胞內(nèi)感染病原體與細(xì)胞自噬相互作用的研究進(jìn)展[J];東南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2010年03期

8 ;《自然-細(xì)胞生物學(xué)》:蛋白抗癌與其誘導(dǎo)細(xì)胞自噬有關(guān)[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2010年20期

9 汪昌麗;滿(mǎn)娜;溫龍平;;納米材料誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的效應(yīng)及生物學(xué)功能[J];東南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2011年01期

10 錢(qián)帥偉;漆正堂;支彩霞;丁樹(shù)哲;;抑癌基因p53與細(xì)胞自噬[J];生命的化學(xué);2011年05期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 許赤;陳文捷;楊楊;李華;易述紅;陳規(guī)劃;;老年大鼠肝臟細(xì)胞自噬及其移植后改變[A];2013中國(guó)器官移植大會(huì)論文匯編[C];2013年

2 劉杰民;紀(jì)云西;蔣歷;黃貴華;鄭超偉;郭超峰;;細(xì)胞自噬是探索中醫(yī)藥微觀機(jī)制的新思路[A];中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)脾胃病分會(huì)第二十四次全國(guó)脾胃病學(xué)術(shù)交流會(huì)論文匯編[C];2012年

3 李康生;代劍平;;病毒感染與細(xì)胞自噬[A];新發(fā)和再發(fā)傳染病防治熱點(diǎn)研討會(huì)論文集[C];2011年

4 楊鍵;鄧玉杰;張曉燕;呂鵬飛;徐俊;楊穎;寧光;;脂肪細(xì)胞自噬檢測(cè)方法的建立及意義探討[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十一次全國(guó)內(nèi)分泌學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2012年

5 陳英;樸英杰;;人肝細(xì)胞自噬性凋亡的形態(tài)學(xué)觀察[A];第十二屆全國(guó)電子顯微學(xué)會(huì)議論文集[C];2002年

6 楊鍵;鄧玉杰;張曉燕;呂鵬飛;徐俊;楊穎;寧光;;脂肪細(xì)胞自噬檢測(cè)方法的建立及意義探討[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)糖尿病學(xué)分會(huì)第十六次全國(guó)學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2012年

7 趙穎;楊靜;廖文娟;劉向宇;張輝;王杉;王冬來(lái);馮京南;俞立;朱衛(wèi)國(guó);;胞漿中Fox01引起細(xì)胞自噬進(jìn)而發(fā)揮抑制腫瘤的功能[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)腫瘤學(xué)分會(huì)第七屆全國(guó)中青年腫瘤學(xué)術(shù)會(huì)議——中華醫(yī)學(xué)會(huì)腫瘤學(xué)分會(huì)“中華腫瘤 明日之星”大型評(píng)選活動(dòng)暨中青年委員全國(guó)遴選論文匯編[C];2011年

8 陳永;鄒s舠，

本文編號(hào)：1351813