本文關(guān)鍵詞：外周血白細胞基因組DNA甲基化在心力衰竭中的作用及臨床意義　出處：《吉林大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：心力衰竭(Heart Failure,HF)主要表現(xiàn)在體循環(huán)靜脈以及肺靜脈的淤血。心衰是一個進展性、不可逆性的病理過程。近年來已明確在心力衰竭發(fā)生、發(fā)展過程中基因表達調(diào)控的變化起著重要的作用。DNA甲基化在哺乳動物中是最常見的表觀遺傳調(diào)節(jié)機制,有可能引發(fā)心衰的發(fā)生和發(fā)展,但大部分的研究都是取材心肌組織,本研究首次對心衰患者外周血白細胞的基因組DNA甲基化進行分析,明確心衰過程中某些基因的甲基化表達水平。本實驗應(yīng)用簡化代表性重亞硫酸鹽測序(RRBS)對DNA序列樣本進行測序;應(yīng)用定量MassARRAY甲基化分析來證實心力衰竭組基因序列的甲基化水平和正常對照組之間的不同,隨后應(yīng)用兩組樣本,我們進行了實時定量PCR檢測,RT-qPCR能夠進一步明確兩組人群不同的基因表達,從而進一步證實RRBS和定量MassARRAY甲基化分析的結(jié)果。最后經(jīng)過酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)方法對各個基因相應(yīng)蛋白的表達水平進行檢測。本研究得出以下結(jié)果:1.經(jīng)過RRBS分析,心力衰竭組外周血白細胞共測出了11228個CG重復(fù)序列;而在正常對照組外周血白細胞中,共確定其中存在10680個CG重復(fù)序列。在兩組的CpG重復(fù)序列中,本研究共分析出了732個差異性甲基化區(qū)域。2.通過定量MassArray甲基化分析的結(jié)果顯示,對于MPV17L基因,心力衰竭組和正常對照組的三個樣本的甲基化水平分別為5.7%,6.7%,6.5%和8.2%,7.8%,8.8%;對于SLC2A1基因,心力衰竭組和正常對照組的三個樣本的甲基化水平分別為21.4%,37.9%,14.3%和37.4%,41.9%,34.7%;對于PLEC基因,心力衰竭組和正常對照組的三個樣本的甲基化水平分別為83.3%,63.8%,62%和57%,59.1%,60.1%。3.RT-qPCR的結(jié)果顯示,外周血白細胞三種目的基因中的SLC2A1基因在心力衰竭組患者的表達水平(0.499±0.388)較正常對照組明顯升高(0.062±0.041,p0.001);MPV17L基因的表達水平(0.003±0.002)較正常對照組明顯升高(0.001±0.001,p=0.003);心力衰竭組患者外周血白細胞PLEC基因的表達水平(0.023±0.014)較正常對照組明顯減低(0.064±0.039,p=0.002)。4.SLC2A1基因啟動子序列甲基化水平與mRNA表達水平呈顯著負相關(guān)(r=-0.089,p=0.042);MPV17L基因的mRNA表達水平與MPV17L基因啟動子序列甲基化水平呈顯著負相關(guān)(r=-0.886,p=0.019);PLEC基因序列甲基化水平與該基因的mRNA表達水平呈顯著負相關(guān)(r=-0.829,p=0.042)。5.心力衰竭患者SLC2A1基因的相關(guān)蛋白的表達水平(5286.3±2558.2pg/ml),較正常對照組明顯升高(2478.9±614.6 pg/ml,p=0.007);心力衰竭患者白細胞中MPV17L基因的相關(guān)蛋白的表達水平為376.1±287.8 pg/ml,較正常對照組明顯升高(155.3±64.9 pg/ml,p=0.04);心力衰竭患者白細胞中PLEC基因的相關(guān)蛋白的表達水平為(35970.4±17646.3 pg/ml),較正常對照組明顯降低(86773.4±47142.4 pg/ml,p=0.03)。結(jié)論:1、和既往取材心肌組織的方法相比,本實驗研究心衰組和對照組之間外周血白細胞中DNA序列甲基化的不同的方法是非常簡單易行的。2、心衰組外周血白細胞中DNA序列的甲基化水平低于正常對照組,有可能是心力衰竭發(fā)生和發(fā)展的機制之一。3、明確了SLC2A1基因、MPV17L基因和PLEC基因在心衰患者中的表達水平以及相應(yīng)蛋白的表達水平,為DNA序列甲基化對于心力衰竭發(fā)生和發(fā)展的作用提供了詳細的臨床依據(jù)。
[Abstract]:Heart failure (Heart Failure, HF) is mainly manifested in the vein of the body and the blood stasis of the pulmonary vein. Heart failure is a progressive and irreversible pathological process. In recent years, the change of gene expression and regulation plays an important role in the process of heart failure and development. DNA methylation in mammals is the most common epigenetic regulatory mechanisms, may lead to the occurrence and development of heart failure, but most of them are based on the analysis of myocardial tissue, DNA methylation for the first time in patients with heart failure and peripheral white blood cells, the level of methylation specific expression of certain genes in chronic heart failure the. The application of simplified representative bisulfite sequencing (RRBS) sequence of DNA sequence samples; using quantitative MassARRAY methylation analysis between different methylation levels to confirmed gene sequence of the failure group and normal control group, followed by the two group samples, we performed quantitative real-time PCR detection, to further clarify the expression of RT-qPCR two groups of different genes, which further confirmed the quantitative analysis of RRBS and MassARRAY methylation results. Finally, the expression level of the corresponding proteins was detected by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). The following results were obtained in this study: 1.. After RRBS analysis, 11228 CG repeats were detected in peripheral blood leukocytes from heart failure group, while 10680 CG repeats were identified in peripheral blood leukocytes of normal control group. In the two groups of CpG repeat sequences, 732 differential methylation regions were analyzed in this study. 2. by quantitative MassArray methylation analysis showed that the MPV17L gene methylation level in a sample of three heart failure group and normal control group were 5.7%, 6.7%, 6.5% and 8.2%, 7.8%, 8.8%; for SLC2A1 gene, methylation level of three samples of heart failure group and normal control group were 21.4% 37.9%, 14.3%, and 37.4%, 41.9%, 34.7%; for PLEC gene, methylation level of three samples of heart failure group and normal control group were 83.3%, 63.8%, 62% and 57%, 59.1%, 60.1%. The results of 3.RT-qPCR showed that peripheral white blood cells of three target genes in SLC2A1 gene expression level in heart failure patients (0.499 + 0.388) was significantly higher than the control (0.062 + 0.041, p0.001); the expression level of MPV17L gene (0.003 + 0.002) compared with the normal control group was significantly higher (0.001. 0.001, p=0.003); the expression level of PLEC in white blood cell in peripheral blood of patients with heart failure were foreign genes (0.023 + 0.014) compared with the normal control group was significantly lower (0.064 + 0.039, p=0.002). 4.SLC2A1 gene promoter methylation level and the expression level of mRNA was negatively correlated (r=-0.089, p=0.042); MPV17L gene expression level of mRNA and MPV17L gene promoter methylation level was negatively correlated (r=-0.886, p=0.019); PLEC gene methylation and the gene expression level of mRNA was negatively correlated (r=-0.829, p=0.042). The expression level of SLC2A1 gene in patients with heart failure related protein 5. of the (5286.3 + 2558.2pg/ml), was obviously higher than normal control group (2478.9 + 614.6 pg/ml, p=0.007); the expression level of MPV17L protein gene of white blood cells in patients with heart failure was 376.1 + 287.8 pg/ml, significantly higher than that in control group (155.3 + 64.9 pg/ml, p=0.04 the expression level of PLEC protein); white blood cells in patients with heart failure gene is (35970.4 + 17646.3 pg/ml), was lower than the control group (86773.4 + 47142.4 pg/ml, p=0.03). Conclusion: 1. Compared with previous methods of myocardial tissue extraction, the methylation of DNA sequence in peripheral blood leukocytes between heart failure group and control group is very simple and feasible. 2. The methylation level of DNA sequence in peripheral blood leukocytes in the heart failure group is lower than that of the normal control group, which may be one of the mechanisms of the occurrence and development of heart failure. 3, we defined the expression level of SLC2A1 gene, MPV17L gene and PLEC gene in heart failure patients and the expression level of corresponding proteins, which provided a detailed clinical basis for the role of DNA sequence methylation in the occurrence and development of heart failure.
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R541.6

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