發(fā)布時(shí)間：2017-12-26 08:16

  本文關(guān)鍵詞：紫草素對(duì)皮膚成纖維細(xì)胞增殖、凋亡的調(diào)控及抑制增生性瘢痕形成的機(jī)制研究　出處：《浙江中醫(yī)藥大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：目的通過(guò)研究Shh信號(hào)通路在人源成纖維細(xì)胞系和分離自增生性瘢痕組織的原代細(xì)胞的激活狀態(tài),特異性調(diào)控Shh信號(hào)通路對(duì)成纖維細(xì)胞增殖、遷移、周期、凋亡等生物學(xué)特性的影響,以及對(duì)一些瘢痕形成關(guān)鍵基因、凋亡關(guān)鍵基因表達(dá)的影響,闡明Shh信號(hào)通路在增生性瘢痕形成過(guò)程中的作用機(jī)制。通過(guò)研究中藥制劑紫草膏中的主要成分紫草素對(duì)成纖維細(xì)胞增殖、遷移、凋亡等生物特性的影響和一些關(guān)鍵基因的表達(dá)變化,以及聯(lián)合Shh信號(hào)通路抑制劑cyclopamine分子對(duì)人源HSF細(xì)胞增殖及關(guān)鍵基因表達(dá)的影響,進(jìn)一步探討增生性瘢痕形成機(jī)制和紫草素對(duì)皮膚成纖維細(xì)胞增殖、凋亡的調(diào)控及抑制增生性瘢痕形成的作用機(jī)制,為進(jìn)一步應(yīng)用開(kāi)發(fā)提供基礎(chǔ)研究依據(jù)。方法1.培養(yǎng)兩種人真皮成纖維細(xì)胞,采用定量PCR法和Western-blot法檢測(cè)細(xì)胞中Shh信號(hào)通路關(guān)鍵基因Ptch-1、Smo和Gli-1等基因的表達(dá)情況。2.采用不同濃度重組人rhShh因子和cyclopamine分子刺激成纖維細(xì)胞,分別應(yīng)用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況,侵襲小室法檢測(cè)細(xì)胞遷移能力變化、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡變化,RT-qPCR和Western-blot法檢測(cè)瘢痕形成相關(guān)基因VEGF和Ⅰ型膠原酶,凋亡相關(guān)基因CyclinD1和Bcl-2基因表達(dá)變化。3.采用不同濃度紫草素干預(yù)成纖維細(xì)胞,分別應(yīng)用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡變化,RT-qPCR法和Western-blot檢測(cè)瘢痕形成相關(guān)基因VEGF和Ⅰ型膠原酶,Shh信號(hào)通路關(guān)鍵基因Ptch-1和Gli-1表達(dá)情況,凋亡相關(guān)基因CyclinD1和Bcl-2基因表達(dá)變化。4.使用紫草素聯(lián)合cyclopamine分子干預(yù)成纖維細(xì)胞,分別應(yīng)用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況,侵襲小室法檢測(cè)細(xì)胞遷移能力變化、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡變化,RT-qPCR法和Western-blot檢測(cè)瘢痕形成相關(guān)基因VEGF和Ⅰ型膠原酶,凋亡相關(guān)基因CyclinD1和Bcl-2基因表達(dá)變化。結(jié)果1.在兩種人源成纖維細(xì)胞中均檢測(cè)到Shh信號(hào)通路基因Ptch-1、Smo和Gli-1表達(dá)均增高,其中HHSF組表達(dá)增高更明顯。2.重組人rhShh可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖,且呈濃度依賴型,當(dāng)rhShh濃度超過(guò)1μg/ml后濃度繼續(xù)增加對(duì)細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用沒(méi)有明顯加強(qiáng),cyclopamine對(duì)成纖維細(xì)胞增殖呈濃度依賴性抑制,濃度超過(guò)8μM時(shí)抑制能力沒(méi)有明顯增強(qiáng),同時(shí)rhShh分子可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞遷移、抑制凋亡,促進(jìn)瘢痕形成相關(guān)基因VEGF和Ⅰ型膠原酶、凋亡相關(guān)基因CyclinDl和Bcl-2高表達(dá),cyclopamine作用與rhShh相反。3.紫草素對(duì)成纖維細(xì)胞的增殖能力有較強(qiáng)的抑制作用,當(dāng)紫草素濃度達(dá)到5μM時(shí),約50%左右的細(xì)胞受到抑制,濃度達(dá)到10μM時(shí)超過(guò)90%的細(xì)胞受到抑制,同時(shí)紫草素可以抑制細(xì)胞遷移,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,可以明顯下調(diào)瘢痕形成相關(guān)基因VEGF和Ⅰ型膠原酶、凋亡相關(guān)基因CyclinD1和Bcl-2的表達(dá);紫草素對(duì)Shh信號(hào)通路基因Ptch-1和Gli-1的表達(dá)有一定的抑制作用,在HHSF組抑制作用更明顯。4.紫草素聯(lián)合Shh信號(hào)通路抑制劑cyclopamine可以增強(qiáng)對(duì)成纖維細(xì)胞增殖的抑制,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,VEGF、Ⅰ型膠原酶和Bcl-2等相關(guān)基因下調(diào)更加明顯。結(jié)論1.Shh信號(hào)通路在瘢痕修復(fù)過(guò)程中的成纖維細(xì)胞中呈激活狀態(tài)。2.阻斷Shh信號(hào)通路可以抑制成纖維細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞凋亡。3.紫草素可以抑制成纖維細(xì)胞過(guò)度增殖,同時(shí)下調(diào)VEGF、Ⅰ型膠原酶、cyclinD1、Bcl-2基因的表達(dá)水平。4.阻斷Shh信號(hào)通路對(duì)紫草素抑制成纖維細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞凋亡有增效作用。
【學(xué)位授予單位】：浙江中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R285

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本文編號(hào)：1336508