本文關(guān)鍵詞：EpCAM負(fù)載DC活化臍帶血初始T細(xì)胞制備CTL的抗腫瘤殺傷效率研究　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：近年來惡性腫瘤治療常規(guī)的治療手段手術(shù)、放療、化療都遇到了相應(yīng)的瓶頸。隨著人們對腫瘤發(fā)生發(fā)展與機(jī)體免疫關(guān)系認(rèn)識的提高,生物治療已成為對抗腫瘤又一手段。生物治療包括細(xì)胞治療和非細(xì)胞治療(基因治療、小分子靶向藥物治療、抗血管生成治療、基因疫苗、單克隆抗體治療、多肽或蛋白質(zhì)疫苗等)。細(xì)胞免疫治療通過向腫瘤患者輸注具有抗腫瘤活性的免疫細(xì)胞,直接殺傷腫瘤細(xì)胞或激發(fā)機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng),從而達(dá)到治療腫瘤的目的,稱為腫瘤過繼細(xì)胞治療(adoptive cell transfer,ACT)。細(xì)胞免疫治療的核心是誘導(dǎo)T細(xì)胞活化并識別腫瘤抗原,從而產(chǎn)生腫瘤殺傷。主要有兩種模式,一是DC誘導(dǎo)的T細(xì)胞免疫,主要通過負(fù)載相應(yīng)抗原的DC,將抗原信息提呈給T細(xì)胞,使T細(xì)胞活化并能特異性識別和殺傷腫瘤細(xì)胞;二是T細(xì)胞工程制備的T細(xì)胞免疫,主要是通過T細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染或基因編輯,使T細(xì)胞能夠特異性識別和殺傷腫瘤細(xì)胞。其中,DC誘導(dǎo)的T細(xì)胞免疫,是細(xì)胞免疫治療的重要研究方向。目前臨床多采用外周血提取單個核細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增活化,應(yīng)用自體或異體腫瘤細(xì)胞制備抗原,進(jìn)而制備抗原特異性殺傷細(xì)胞,對患者進(jìn)行過繼回輸治療,取得了一定的療效。但因腫瘤患者自身狀況、T細(xì)胞功能狀態(tài)、抗原的特異性、以及腫瘤微環(huán)境等問題限制了其臨床有效性。首先,目前臨床應(yīng)用的DC細(xì)胞和T細(xì)胞的來源主要通過患者自體外周血單個核細(xì)胞采集。而腫瘤的“免疫抑制微環(huán)境”導(dǎo)致自體DC和T細(xì)胞的功能障礙及數(shù)量不足,晚期腫瘤患者不能耐受大量的外周血單個核細(xì)胞的采集及個體化限制等問題,致使臨床采集DC和T細(xì)胞所制備的效應(yīng)細(xì)胞功能和數(shù)量存在缺陷,以及效應(yīng)細(xì)胞制備的規(guī)�；彤a(chǎn)業(yè)化受限。近些年有研究表明,不同的T細(xì)胞亞群制備的效應(yīng)細(xì)胞具有不同的抗腫瘤效應(yīng)。其中,初始T細(xì)胞亞群相較于記憶性T細(xì)胞具有更強(qiáng)的抗腫瘤能力。臍帶血來源的T淋巴細(xì)胞較外周血來源T淋巴細(xì)胞具有更強(qiáng)的擴(kuò)增及活化能力,目前廣泛應(yīng)用于血液系統(tǒng)腫瘤,而且針對實(shí)體腫瘤亦表現(xiàn)出了較強(qiáng)的殺傷效率。但目前還沒有研究具體分析臍帶血來源初始T細(xì)胞亞群的抗腫瘤能力。其次,自體腫瘤抗原臨床難以獲取,是臨床制備腫瘤特異性、治療型DC疫苗及腫瘤特異性T殺傷細(xì)胞制劑的難點(diǎn),因而,尋找具有臨床通用性的腫瘤抗原,是目前研究重點(diǎn)之一。上皮細(xì)胞粘附分子(epithelial-specific cell adhesion molecule,Ep CAM)是最早發(fā)現(xiàn)的腫瘤相關(guān)抗原之一,但最初并沒有作為腫瘤治療的靶點(diǎn)而得到相應(yīng)的重視。Ep CAM在多種腺癌細(xì)胞表面表達(dá)明顯升高,包括乳腺癌、胃癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌、卵巢癌等。近年來,隨著靶向藥物的廣泛應(yīng)用和取得的良好成果,Ep CAM作為細(xì)胞免疫治療新靶點(diǎn)的研究受到高度關(guān)注,已有研究表明,Ep CAM靶向T效應(yīng)細(xì)胞制劑,能夠獲得良好的臨床殺傷效率。而以Ep CAM為靶向抗原,誘導(dǎo)臍血來源初始T殺傷效率研究尚未得到實(shí)驗(yàn)證實(shí)。本研究旨在探討臍血來源初始T細(xì)胞亞群的擴(kuò)增活化能力及體內(nèi)外抗腫瘤能力,以及Ep CAM純蛋白誘導(dǎo)DC成熟,進(jìn)而制備Ep CAM特異性CTL,并探討其對高表達(dá)Ep CAM的腺癌細(xì)胞的體內(nèi)外殺傷效應(yīng),為突破個體化限制,實(shí)現(xiàn)規(guī)模化、產(chǎn)業(yè)化制備效應(yīng)細(xì)胞,提供初步的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。第一部分臍帶血來源初始T細(xì)胞增值活化能力的實(shí)驗(yàn)研究目的:從臍帶血中分離并大量擴(kuò)增初始T細(xì)胞,并驗(yàn)證其大批量擴(kuò)增和活化能力。方法:密度梯度離心法分離獲取臍帶血及外周血單狀核細(xì)胞,CD45RO磁珠陰性篩選臍帶血單狀核細(xì)胞,進(jìn)一步CD62L磁珠陽性篩選獲取CD62L+CD45RO-的初始T淋巴細(xì)胞。MTS法檢測T淋巴細(xì)胞的增殖活性。ELISA法檢測T淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ的能力。流式方法檢測T細(xì)胞表面抗原CD3、CD4、CD8、CD45RA、CD62L的表達(dá)。結(jié)果:1初始T細(xì)胞是臍帶血及外周血T細(xì)胞中最大的亞群,臍帶血中初始T細(xì)胞亞群占67.57±6.53%;外周血中初始T細(xì)胞亞群占50.66±5.79%。2臍帶血中初始T細(xì)胞比例較外周血中初始T細(xì)胞比例高(P0.05);3臍帶血及外周血來源的初始T細(xì)胞增殖能力高于其他亞群(P0.05);4臍帶血初始T細(xì)胞增殖能力顯著高于外周血初始T細(xì)胞(P0.05);5經(jīng)2周培養(yǎng)擴(kuò)增后,臍帶血CD45RA+CD62L+T細(xì)胞比例顯著高于外周血(P0.05);6經(jīng)2周培養(yǎng)擴(kuò)增后,CD8+T細(xì)胞比例逐漸升高,臍帶血來源初始T更顯著(P0.05);7經(jīng)2周培養(yǎng)擴(kuò)增后,相較于外周血來源初始T細(xì)胞及其他亞群,臍帶血來源初始T細(xì)胞仍為較低的IFN-γ分泌能力(P0.05)。結(jié)論:臍帶血中具有豐富的初始T細(xì)胞,而且相對于外周血來源初始T細(xì)胞,具有更強(qiáng)的增殖活化能力,而且經(jīng)擴(kuò)增培養(yǎng)后,其細(xì)胞表面CD62L、CD45RA仍高表達(dá),而分泌能力弱,繼續(xù)保持初始狀態(tài)。第二部分Ep CAM誘導(dǎo)DC成熟及誘導(dǎo)T細(xì)胞活化的實(shí)驗(yàn)研究目的:通過Ep CAM誘導(dǎo)DC成熟,進(jìn)而激活初始T細(xì)胞制備細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞。方法:密度梯度離心法分離臍帶血及外周血單狀核細(xì)胞,貼壁法獲得DC細(xì)胞。擴(kuò)增培養(yǎng)后分別用cocktail(TNF-α,IL1β,IL-6,IFN-γ,poly I:C)+腫瘤細(xì)胞裂解物、cocktail+Ep CAM刺激DC細(xì)胞成熟。流式方法檢測未成熟DCs(im DCs)及成熟DCs(m DCs)表面HLA-DR、CD80、CD83、CD86的表達(dá)量。成熟DCs與初始T細(xì)胞共培養(yǎng),進(jìn)而活化初始T細(xì)胞成為細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)。流式方法檢測CTL細(xì)胞表面CD3、CD4、CD8、CD45RA、CD62L的表達(dá)。ELISA法檢測CTL細(xì)胞分泌IFN-γ的能力。結(jié)果:1刺激DC成熟后,DC表面的HLA-DR、CD80、CD83、CD86的表達(dá)較成熟前明顯升高(P0.05);2通過cocktail+腫瘤裂解物或cocktail+Ep CAM刺激的成熟DC之間表面抗原的表達(dá)無明顯差異(P0.05);3臍帶血來源DC成熟與外周血來源DC成熟后表面分子表達(dá)水平無明顯差異(P0.05);4制備的CTL細(xì)胞表面抗原CD45RA、CD62L表達(dá)水平顯著下降,臍帶血來源CTL細(xì)胞更為明顯(P0.05),但通過不同DC活化的CTL細(xì)胞之間無顯著差異(P0.05);5臍帶血來源CTL細(xì)胞比外周血來源CTL細(xì)胞CD8+所占比例高(P0.05);但通過不同DC活化的CTL細(xì)胞之間無顯著差異(P0.05);6臍帶血來源CTL細(xì)胞較外周血來源CTL細(xì)胞具有更強(qiáng)的IFN-γ分泌能力(P0.05);初始T細(xì)胞來源CTL細(xì)胞比記憶T細(xì)胞來源CTL細(xì)胞具有更強(qiáng)的IFN-γ分泌能力(P0.05);但通過不同DC活化的CTL細(xì)胞之間無顯著差異(P0.05)。結(jié)論:通過Ep CAM或腫瘤裂解物均可刺激DC細(xì)胞成熟,并能進(jìn)一步活化初始T細(xì)胞成為細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞;臍帶血來源的CTL具有更強(qiáng)的活化及分泌能力,其中初始T細(xì)胞來源的CTL擁有更強(qiáng)的活化及分泌能力。第三部分制備的CTL在體內(nèi)外對Ep CAM抗原高表達(dá)腫瘤的特異性殺傷效應(yīng)研究目的:驗(yàn)證制備的CTL細(xì)胞的體內(nèi)外特異性殺傷效應(yīng)。進(jìn)一步評估應(yīng)用臍帶血初始T細(xì)胞批量制備Ep CAM抗原特異性CTL的可行性。方法:1流式方法檢測靶細(xì)胞LS174-T、Pa Ca-2表面Ep CAM的表達(dá)情況。2各命名簡寫方式:臍帶血(cord blood,CB);外周血(peripheral blood,PB);初始T細(xì)胞(na?ve T cell,n);記憶T細(xì)胞(memory T cell,m);Ep CAM抗原(Ep);腫瘤裂解物(tumor lysate,T);細(xì)胞毒T細(xì)胞(cytotoxic T lymphocytes,CTL);3臍帶血來源初始T細(xì)胞與記憶T細(xì)胞制備的CTL體外殺傷實(shí)驗(yàn)。分組:(1)實(shí)驗(yàn)組(初始T細(xì)胞制備的CTL,CB-CTLn),包括Ep CAM誘導(dǎo)活化的CTL(CB-Ep-CTLn)及腫瘤裂解物活化的CTL(CB-T-CTLn);(2)對照組(記憶T細(xì)胞制備的CTL,CB-CTLm),包括Ep CAM誘導(dǎo)活化的CTL(CB-Ep-CTLm)及腫瘤裂解物活化的CTL(CB-T-CTLm);(3)空白對照組;靶細(xì)胞:LS174-T;應(yīng)用MTS法檢測效應(yīng)細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。4外周血來源初始T細(xì)胞與記憶T細(xì)胞制備的CTL體外殺傷實(shí)驗(yàn)。分組:(1)實(shí)驗(yàn)組(初始T細(xì)胞制備的CTL,PB-CTLn),包括Ep CAM誘導(dǎo)活化的CTL(PB-Ep-CTLn)及腫瘤裂解物活化的CTL(PB-T-CTLn);(2)對照組(記憶T細(xì)胞制備的CTL,PB-CTLm),包括Ep CAM誘導(dǎo)活化的CTL(PB-Ep-CTLm)及腫瘤裂解物活化的CTL(PB-T-CTLm);(3)空白對照組;靶細(xì)胞:LS174-T;應(yīng)用MTS法檢測效應(yīng)細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。5臍帶血與外周血來源初始T細(xì)胞制備的CTL體外殺傷實(shí)驗(yàn)。(1)實(shí)驗(yàn)組(CB-Ep-CTLn、CB-T-CTLn);(2)對照組(PB-Ep-CTLn、PB-T-CTLn);(3)空白對照組(PBS)。6體外特異性殺傷驗(yàn)證。分組:(1)實(shí)驗(yàn)組(CB-Ep-CTLn、CB-Ep-CTLm、PB-Ep-CTLn、PB-Ep-CTLm),靶細(xì)胞:LS174-T;(2)對照組(CB-Ep-CTLn、CB-Ep-CTLm、PB-Ep-CTLn、PB-Ep-CTLm),靶細(xì)胞:Pa Ca-2、LS174-T(用抗Ep CAM抗體阻斷細(xì)胞表面Ep CAM抗原);(3)空白對照組(PBS),靶細(xì)胞:LS174-T、Pa Ca-2;MTS法檢測效應(yīng)細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。7制備動物模型。實(shí)驗(yàn)動物:4周齡雄性NOD/SCID小鼠。取1×106個靶細(xì)胞(0.1ml)于NOD/SCID小鼠左前肢內(nèi)側(cè)皮下注射,大約10天后,腫瘤平均大小為0.5mm3(體積=長度×寬度2÷2)。8臍帶血來源初始T細(xì)胞與記憶T細(xì)胞制備的CTL體內(nèi)抑瘤效應(yīng)。分組:(1)實(shí)驗(yàn)組(CB-Ep-CTLn、CB-T-CTLn);(2)對照組(CB-Ep-CTLm、CB-T-CTLm);(3)空白對照組(PBS);LS 174-T荷瘤小鼠尾靜脈注射1×107個效應(yīng)細(xì)胞,隔天測量腫瘤大小,以腫瘤體積達(dá)到2 mm3為觀察終點(diǎn)。9外周血來源初始T細(xì)胞與記憶T細(xì)胞制備的CTL體內(nèi)抑瘤效應(yīng)。分組:(1)實(shí)驗(yàn)組(PB-Ep-CTLn、PB-T-CTLn);(2)對照組(PB-Ep-CTLm、PB-T-CTLm);(3)空白對照組(PBS);LS 174-T荷瘤小鼠尾靜脈注射1×107個效應(yīng)細(xì)胞,隔天測量腫瘤大小,以腫瘤體積達(dá)到2 mm3為觀察終點(diǎn)。10體內(nèi)特異性抑瘤效應(yīng)驗(yàn)證。分組:(1)實(shí)驗(yàn)組(CB-Ep-CTLn、CB-Ep-CTLm、PB-Ep-CTLn、PB-Ep-CTLm),實(shí)驗(yàn)組動物:LS174-T荷瘤小鼠;(2)對照組(CB-Ep-CTLn、CB-Ep-CTLm、PB-Ep-CTLn、PB-Ep-CTLm),實(shí)驗(yàn)組動物:Pa Ca-2荷瘤小鼠;(3)空白對照組(PBS),實(shí)驗(yàn)動物:LS174-T荷瘤小鼠、Pa Ca-2荷瘤小鼠;尾靜脈注射1×107個效應(yīng)細(xì)胞,隔天測量腫瘤大小,以腫瘤體積達(dá)到2 mm3為觀察終點(diǎn)。結(jié)果:1 LS174-T細(xì)胞表面抗原Ep CAM表達(dá)為99.22±0.42%;Pa Ca-2細(xì)胞表面抗原Ep CAM表達(dá)為5.69±0.89%。兩者滿足作為針對Ep CAM特異性殺傷研究靶細(xì)胞的要求。2 CB-Ep-CTLn較CB-Ep-CTLm對LS174-T細(xì)胞有更強(qiáng)的體外殺傷效應(yīng)(P0.05);CB-T-CTLn較CB-T-CTLm對LS174-T細(xì)胞有更強(qiáng)的體外殺傷效應(yīng)(P0.05)。CB-Ep-CTLn較CB-T-CTLn對LS174-T細(xì)胞有更強(qiáng)的體外殺傷效應(yīng)(P0.05)。CB-Ep-CTLm與CB-T-CTLm對LS174-T細(xì)胞的體外殺傷無明顯差異(P0.05)。3 PB-Ep-CTLn較PB-Ep-CTLm對LS174-T細(xì)胞有更強(qiáng)的體外殺傷效應(yīng)(P0.05);PB-T-CTLn較PB-T-CTLm對LS174-T細(xì)胞有更強(qiáng)的體外殺傷效應(yīng)(P0.05);PB-Ep-CTLn較PB-T-CTLn對LS174-T細(xì)胞有更強(qiáng)的體外殺傷效應(yīng)(P0.05)。PB-Ep-CTLm與PB-T-CTLm對LS174-T細(xì)胞的體外殺傷無明顯差異(P0.05)。4 CB-Ep-CTLn較PB-Ep-CTLn對LS174-T細(xì)胞有更強(qiáng)的體外殺傷效應(yīng)(P0.05);CB-T-CTLn較PB-T-CTLn對LS174-T細(xì)胞有更強(qiáng)的體外殺傷效應(yīng)(P0.05)。5 CB-Ep-CTLn對LS174-T體外殺傷效應(yīng)強(qiáng),對Pa Ca-2體外殺傷效應(yīng)弱(P0.05);PB-Ep-CTLn對LS174-T體外殺傷效應(yīng)強(qiáng),對Pa Ca-2體外殺傷效應(yīng)弱(P0.05);在靶細(xì)胞中事先加入抗Ep CAM抗體后,CB-Ep-CTLn、PB-Ep-CTLn對LS174-T靶細(xì)胞的殺傷效應(yīng)均出現(xiàn)明顯下降(P0.05)。6 CB-Ep-CTLn較CB-Ep-CTLm對LS174-T荷瘤小鼠具有更強(qiáng)的抑瘤作用(P0.05);CB-T-CTLn較CB-T-CTLm對LS174-T荷瘤小鼠有更強(qiáng)的抑瘤作用(P0.05);CB-Ep-CTLn較CB-T-CTLn對LS174-T荷瘤小鼠有更強(qiáng)的抑瘤作用(P0.05)。7 PB-Ep-CTLn較PB-Ep-CTLm對LS174-T荷瘤小鼠具有更強(qiáng)的抑瘤作用(P0.05);PB-T-CTLn較PB-T-CTLm對LS174-T荷瘤小鼠有更強(qiáng)的抑瘤作用(P0.05);PB-Ep-CTLn較PB-T-CTLn對LS174-T荷瘤小鼠有更強(qiáng)的抑瘤作用(P0.05)。8 CB-Ep-CTLn較PB-Ep-CTLn對LS174-T荷瘤小鼠具有更強(qiáng)的抑瘤作用(P0.05);CB-T-CTLn較PB-T-CTLn對LS174-T荷瘤小鼠有更強(qiáng)的抑瘤效應(yīng)(P0.05)。9 CB-Ep-CTL對LS174-T荷瘤小鼠有強(qiáng)的抑瘤作用,對Pa Ca-2荷瘤小鼠抑瘤作用不明顯(P0.05);PB-Ep-CTL對LS174-T荷瘤小鼠有較強(qiáng)的抑瘤作用,對Pa Ca-2荷瘤小鼠抑瘤作用不明顯(P0.05)。結(jié)論:1臍帶血或外周血來源的初始T細(xì)胞制備的CTL較記憶T細(xì)胞制備的CTL在體內(nèi)外具有更強(qiáng)的抗腫瘤能力。2通過Ep CAM誘導(dǎo)的CTL較腫瘤裂解物誘導(dǎo)的CTL具有更強(qiáng)的抗腫瘤能力。3臍帶血來源的初始T細(xì)胞制備的CTL較外周血來源的初始T細(xì)胞制備的CTL具有更強(qiáng)的抗腫瘤能力。4通過Ep CAM誘導(dǎo)的CTL具有針對高Ep CAM表達(dá)腫瘤的特異性殺傷能力。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R730.51

【參考文獻(xiàn)】

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