本文關(guān)鍵詞：顱內(nèi)鐵離子超載在脊髓損傷后中樞性疼痛中的作用研究　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：前言脊髓損傷(spinal cold injury,SCI)患者中有60%-90%在損傷發(fā)生后會(huì)出現(xiàn)中樞性疼痛(central pain,CP)。中樞性疼痛是一種神經(jīng)性疼痛綜合征,是由脊髓損傷或腦損傷導(dǎo)致的疼痛過敏,其引起的下肢疼痛往往持續(xù)存在并難以忍受,給患者帶來了極大痛苦,因此脊髓損傷后發(fā)生的中樞性疼痛是臨床醫(yī)生不得不面對(duì)的難題。目前對(duì)于脊髓損傷后中樞性疼痛的發(fā)生機(jī)制尚不是十分清楚。近年來越來越多的研究認(rèn)為脊髓損傷后大腦結(jié)構(gòu)和功能的重塑可能是脊髓損傷后中樞性疼痛的重要原因。在我院前期工作中,我們運(yùn)用了磁敏感加權(quán)成像技術(shù)(SWI),對(duì)脊髓損傷患者的大腦功能重塑情況展開了研究。發(fā)現(xiàn):脊髓損傷后中樞性疼痛患者腦內(nèi)鐵離子超載的區(qū)域和大腦結(jié)構(gòu)功能重塑的區(qū)域很相似(包括感覺皮層、丘腦等區(qū)域)。這意味著顱內(nèi)鐵離子超載可能參與了中樞性疼痛的發(fā)病。研究發(fā)現(xiàn),顱內(nèi)鐵離子超載在一些中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病,例如阿爾茲海默病、帕金森病、腦出血等疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。以往的研究認(rèn)為鐵離子的毒性與通過Feteon反應(yīng)直接引起神經(jīng)元的氧化應(yīng)激損傷有關(guān),近年來研究發(fā)現(xiàn),鐵離子超載可以激活腦內(nèi)的小膠質(zhì)細(xì)胞,參與到神經(jīng)元損傷的啟動(dòng)和放大過程。激活的小膠質(zhì)細(xì)胞可以調(diào)節(jié)細(xì)胞因子如IL-1β、TNF-a以及過氧化物NO的水平;這些前炎癥細(xì)胞因子或活性氧化分子所形成的級(jí)聯(lián)效應(yīng)進(jìn)入惡性循環(huán),最終導(dǎo)致神經(jīng)元的損傷或丟失。同時(shí)又有研究證實(shí):小膠質(zhì)細(xì)胞的活化,可能跟細(xì)胞內(nèi)NF-κB信號(hào)通路的活化有關(guān)。1.研究目的本研究希望能夠通過實(shí)驗(yàn)了解鐵離子超載及小膠質(zhì)細(xì)胞激活在脊髓損傷后中樞性疼痛中發(fā)揮的作用。為應(yīng)用NOS抑制劑、鐵螯合劑、小膠質(zhì)細(xì)胞激活抑制劑治療脊髓損傷后中樞性疼痛提供理論基礎(chǔ)。2.材料與方法本研究共分為四個(gè)部分:(1)脊髓損傷后中樞性疼痛模型構(gòu)建及評(píng)價(jià)雌性SD大鼠75只,隨機(jī)分成5組每組15只。假手術(shù)組:僅行椎板切除術(shù),未損傷脊髓,不做任何特殊處理。脊髓損傷組:采用Allen氏重物墜擊法制作脊髓損傷模型,不做任何特殊處理。NOS抑制劑組:造模后應(yīng)用左旋精氨酸(L-arginine)干預(yù)。鐵螯合劑組:造模后應(yīng)用去鐵胺(deferoxamine DFX)干預(yù)。小膠質(zhì)細(xì)胞激活抑制劑組:造模后應(yīng)用米諾環(huán)素(minocycline)干預(yù)。通過對(duì)手術(shù)后大鼠對(duì)后肢和尾部修飾、搔抓、舔咬及自發(fā)嘶叫等自發(fā)痛現(xiàn)象對(duì)大鼠自發(fā)痛作出評(píng)定,并使用智能熱板儀測(cè)定手術(shù)后大鼠后肢熱痛敏潛伏期(PWL)以評(píng)定誘發(fā)痛水平。(2)脊髓損傷后腦內(nèi)鐵離子的積累情況:采用原子吸收分光光度法測(cè)定大鼠全腦及后肢感覺區(qū)、丘腦、扣帶回組織鐵含量。(3)脊髓損傷后腦內(nèi)鐵離子超載發(fā)生機(jī)制采用Real-time PCR法測(cè)定各組大鼠后肢感覺皮層、扣帶回、丘腦等區(qū)域內(nèi)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1(Tf R1)m RNA的表達(dá)水平。采用ELISA法測(cè)定各組大鼠初級(jí)感覺皮層、丘腦、扣帶回中轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1(Tf R1)以鐵蛋白(Fn)含量。采用Western Blot檢測(cè)各組大鼠后肢感覺皮層內(nèi)鐵調(diào)節(jié)蛋白1(IRP1)、鐵蛋白(Fn)、乳鐵蛋白(Lf)和NF-κB含量(4)脊髓損傷后小膠質(zhì)細(xì)胞活化及其發(fā)生機(jī)制通過免疫組織化學(xué)染色法觀察大鼠后感覺皮層內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞活化情況和IRP1含量。本文統(tǒng)計(jì)學(xué)處理均采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,實(shí)驗(yàn)結(jié)果以x?s表示,選用均值差t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較,P0.05則認(rèn)為差異有顯著性。3.結(jié)果:(1)神經(jīng)源性疼痛的動(dòng)物模型的自發(fā)痛主要表現(xiàn)為對(duì)損傷平面以下搔抓、噬咬現(xiàn)象。脊髓損傷后大鼠出現(xiàn)對(duì)損傷部位以下軀體、后爪和尾部的噬咬、搔抓等過度修飾行為,嚴(yán)重的甚至出現(xiàn)自殘;而假手術(shù)組中未觀察到以上現(xiàn)象發(fā)生。脊髓損傷組熱痛閾值較其余各組明顯降低(p0.05)。觀察各組各時(shí)間節(jié)點(diǎn)熱痛潛伏期可見假手術(shù)組在各組間處于較高水平,而脊髓損傷組處于較低水平。(2)各組全腦鐵含量比較未見明顯差異。后肢感覺區(qū)、扣帶回、丘腦鐵含量測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)假手術(shù)組上述腦區(qū)中鐵含量較其余各組明顯降低(p0.05),脊髓損傷組及小膠質(zhì)細(xì)胞激活抑制劑組上述腦區(qū)中鐵含量較其余各組明顯升高(p0.05)。(3)通過WB法對(duì)各組大鼠后肢感覺區(qū)IRP1、Fn、NF-κB、LF含量測(cè)定,可發(fā)現(xiàn)假手術(shù)組后肢感覺區(qū)中IRP1、NF-κB含量較其余各組明顯降低(p0.05),而Fn含量較其他各組明顯升高(p0.05)。脊髓損傷組中IRP1、NF-κB含量較假手術(shù)組、NOS抑制劑組、鐵螯合劑組明顯升高(p0.05);Fn含量較假手術(shù)組、NOS抑制劑組、鐵螯合劑組明顯降低(p0.05)。使用NOS抑制劑可以降低脊髓損傷后IRP1、NF-κB含量,提高Fn含量。使用鐵螯合劑可降低脊髓損傷后NF-κB含量,提高Fn含量,對(duì)IRP1含量無影響。使用小膠質(zhì)細(xì)胞激活抑制劑對(duì)上述蛋白含量無影響。各組中LF比較未見明顯差異。通過ELISA法對(duì)各組大鼠后肢感覺區(qū)、丘腦、扣帶回中Tf R1、Fn、含量測(cè)定,可發(fā)現(xiàn)假手術(shù)組各腦區(qū)中Tf R1含量較其余各組明顯降低(p0.05),而Fn含量較其他各組明顯升高(p0.05)。脊髓損傷組中Tf R1含量較假手術(shù)組、NOS抑制劑組、鐵螯合劑組明顯升高(p0.05);Fn含量較假手術(shù)組、NOS抑制劑組、鐵螯合劑組明顯降低(p0.05)。使用精氨酸可以降低脊髓損傷后Tf R1含量(p0.05),提高Fn含量(p0.05)。使用去鐵胺后可提高脊髓損傷后Fn含量(p0.05),對(duì)Tf R1含量無影響。使用米諾環(huán)素對(duì)Tf R1、Fn蛋白含量無影響。通過RT-PCR法對(duì)各組大鼠后肢感覺區(qū)、丘腦、扣帶回中Tf R1基因含量測(cè)定可發(fā)現(xiàn)假手術(shù)組各腦區(qū)中Tf R1基因含量較其余各組明顯降低(p0.05),脊髓損傷組中Tf R1基因含量較假手術(shù)組、NOS抑制劑組明顯升高(p0.05);使用精氨酸可以降低脊髓損傷后Tf R1含量(p0.05)。(4)通過對(duì)各組大鼠后肢感覺區(qū)內(nèi)的小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行免疫組化法染色可觀察到:脊髓損傷后小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量明顯增加激活狀態(tài)使用NOS抑制劑、鐵螯合劑、小膠質(zhì)細(xì)胞激活抑制劑干預(yù)后,小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目減少且激活程度減低。通過對(duì)各組大鼠后肢感覺區(qū)內(nèi)的IRP1進(jìn)行免疫組化法染色可觀察到:脊髓損傷后IRP1數(shù)量明顯增加,使用NOS抑制劑干預(yù)后,IRP1含量減少。4.結(jié)論(1)采用Allen氏重物墜擊法建立大鼠脊髓損傷模型可以誘發(fā)損傷平面以下的中樞性神經(jīng)性疼痛;(2)脊髓損傷后大鼠全腦鐵含量保持恒定。丘腦、扣帶回、后肢感覺區(qū)出現(xiàn)了IRP1升高、Tf R1升高、Fn降低,鐵離子含量增高,后肢感覺區(qū)出現(xiàn)了小膠質(zhì)細(xì)胞的激活;(3)使用NOS抑制劑干預(yù)可以使大鼠腦內(nèi)丘腦、扣帶回、后肢感覺區(qū)內(nèi)IRP1降低、Tf R1降低、Fn升高,降低上述腦區(qū)內(nèi)鐵含量,抑制后肢感覺區(qū)內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞激活,增高損傷平面以下熱痛閾值;(4)通過鐵螯合劑干預(yù)可以使大鼠腦內(nèi)丘腦、扣帶回、后肢感覺區(qū)內(nèi)Fn升高,降低上述腦區(qū)內(nèi)鐵含量,抑制后肢感覺區(qū)內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞激活,增高損傷平面以下熱痛閾值;(5)采取小膠質(zhì)細(xì)胞激活抑制劑干預(yù)可以使抑制大鼠腦內(nèi)后肢感覺區(qū)內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞激活,增高損傷平面以下熱痛閾值;(6)在脊髓損傷后存在著如下通路導(dǎo)致了中樞性神經(jīng)性疼痛的發(fā)生:脊髓損傷引起應(yīng)激狀態(tài)→下丘腦-垂體-腎上腺軸的激活→糖皮質(zhì)激素的異常增高→一氧化氮合酶激活→NO自由基增多→鐵調(diào)節(jié)蛋白/鐵反應(yīng)元件活化→顱內(nèi)鐵離子超載→NF-κB信號(hào)通路活化→小膠質(zhì)細(xì)胞激活→腦功能性重構(gòu)→中樞性神經(jīng)性疼痛產(chǎn)生。(7)應(yīng)用NOS抑制劑、鐵離子螯合劑、小膠質(zhì)細(xì)胞抑制劑能夠使得脊髓損傷后中樞性神經(jīng)性疼痛癥狀得到緩解。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R651.2

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