本文關(guān)鍵詞：組蛋白去乙�；�2及白介素17A在慢阻肺及哮喘中的分子機(jī)制研究　出處：《浙江大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：慢性阻塞性肺疾病(簡稱慢阻肺)和支氣管哮喘(簡稱哮喘)是最常見的慢性氣道炎癥性疾病。WHO最新數(shù)據(jù)顯示,全球慢阻肺患者已超過2.3億,且病死率逐年上升,預(yù)計(jì)到2020年慢阻肺將成為全球第三大死因。目前,中國約有4.5千萬慢阻肺患者,慢阻肺已經(jīng)成為中國城市第四大死因、中國農(nóng)村第一大死因。目前,全世界約有3億哮喘病人,中國約有3千萬哮喘患者,是全球哮喘病死率最高的國家之一。慢阻肺和哮喘嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量,給患者及家庭、社會造成巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此,研究慢阻肺及哮喘的發(fā)病機(jī)制及有效治療方法的研究顯得非常緊迫。慢阻肺是一種可防可治的慢性氣道炎癥性疾病,疾病發(fā)展過程伴有不完全可逆的氣流受限。吸煙是慢阻肺最主要的誘發(fā)因素,但其發(fā)病機(jī)制目前仍未闡明。慢阻肺氣道炎癥主要為Th1及TC1型免疫反應(yīng),中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及CD8+T細(xì)胞增多,并有粘液高分泌和纖毛粘液清除功能減弱。越來越多的證據(jù)表明,慢阻肺的發(fā)病過程與氣道的免疫反應(yīng)緊密相關(guān)。大量研究表明慢阻肺患者對激素治療不敏感,吸入激素對炎癥細(xì)胞的數(shù)量以及前炎癥介質(zhì)的釋放均無影響。目前對慢阻肺仍缺乏有效的防治手段。一般認(rèn)為哮喘的發(fā)病機(jī)制主要涉及Th1/Th2細(xì)胞免疫失衡,它是一種以嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞參與,氣道粘液高分泌、氣道高反應(yīng)性和氣道重構(gòu)為特征的氣道慢性炎癥性疾病。吸入糖皮質(zhì)激素是目前治療哮喘最有效的方法之一,對激素敏感的哮喘病人大多存在嗜酸粒細(xì)胞性氣道炎癥。但有研究表明,部分哮喘患者存在中性粒細(xì)胞性氣道炎癥反應(yīng),而這些患者大多為重癥哮喘。臨床上發(fā)現(xiàn)這些重癥哮喘患者對糖皮質(zhì)激素治療不敏感,表現(xiàn)為激素低效或者激素抵抗。其炎癥特征不同于輕度哮喘,而與慢阻肺相似。臨床研究發(fā)現(xiàn),慢阻肺和重癥哮喘患者中組蛋白去乙�；�2(HDAC2)的表達(dá)水平和活性均顯著降低,并可能是導(dǎo)致這些慢性氣道炎癥患者激素不敏感的重要因素。新近研究表明,以中性粒細(xì)胞反應(yīng)為主的慢性氣道炎癥與ThI7密切相關(guān)。Th17細(xì)胞是一類能分泌IL-17A-F以及IL-22等細(xì)胞因子的新型效應(yīng)CD4+T細(xì)胞亞群。臨床研究發(fā)現(xiàn),IL-17A的表達(dá)水平與哮喘病人的病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān),重度哮喘患者血清中IL-17A表達(dá)水平較輕、中度患者明顯增高,激素抵抗的重癥哮喘患者IL-17A的水平與氣道中性粒細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)。Th17相關(guān)的炎癥因子在慢阻肺患者的氣道粘液中表達(dá)水平增高。這些研究表明,Th17細(xì)胞在中性粒細(xì)胞性氣道炎癥的分子發(fā)病機(jī)制中起重要作用。Th17早期分化依賴于IL-1信號途徑與IL-6等的聯(lián)合作用,而在慢性氣道炎癥中,這些炎癥因子的產(chǎn)生可能與HDAC2有關(guān)。HDAC與組蛋白乙�；D(zhuǎn)移酶(HAT)兩者之間的動(dòng)態(tài)平衡控制著組蛋白的乙酰化水平和染色質(zhì)的結(jié)構(gòu),從分子轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控各種炎癥基因的表達(dá),從而在慢性氣道炎癥中起重要作用。HDAC2活性下降增加了組蛋白的乙酰化水平,從而導(dǎo)致NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子活性增加,相關(guān)炎癥因子包括IL-6以及pro-IL-1β等表達(dá)增高。據(jù)此我們假設(shè),HDAC2與IL-17A之間可能存在相互調(diào)控作用,HDAC2調(diào)控IL-1β和IL-6等炎癥因子產(chǎn)生,繼而調(diào)控Th17的分化和中性粒細(xì)胞性氣道炎癥反應(yīng),從而在慢阻肺和重癥哮喘的分子發(fā)病過程中起關(guān)鍵作用。本課題通過收集慢阻肺及哮喘患者的臨床標(biāo)本,利用HDAC2、IL-17A基因敲除小鼠構(gòu)建慢阻肺及哮喘模型,體外利用人氣道上皮細(xì)胞,分離培養(yǎng)原代人及小鼠肺成纖維細(xì)胞等方法,研究HDAC2及IL-17A相互調(diào)控作用在慢阻肺氣道重構(gòu)及哮喘氣道炎癥中的機(jī)制。第一部分HDAC2抑制IL-17A介導(dǎo)的慢阻肺氣道重構(gòu)的機(jī)制研究背景及目的:氣道重構(gòu)是慢阻肺發(fā)病機(jī)制的主要特征之一,目前其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。該部分通過收集臨床標(biāo)本(如誘導(dǎo)痰、肺組織),利用轉(zhuǎn)基因小鼠構(gòu)建熏煙煙霧誘導(dǎo)的慢阻肺模型,體外利用人氣道上皮細(xì)胞,分離培養(yǎng)原代人及小鼠肺成纖維細(xì)胞,探討HDAC2能否通過調(diào)控IL-17A表達(dá)緩解慢阻肺氣道重構(gòu)及其相關(guān)機(jī)制。方法:收集正常健康人及慢阻肺患者的臨床資料、肺功能、誘導(dǎo)痰及高分辨率CT(HRCT)評估支氣管壁厚度。用ELISA及免疫組化檢測誘導(dǎo)痰HDAC2及IL-17A表達(dá)。收集慢阻肺合并肺癌患者手術(shù)的切除癌旁正常肺組織,用免疫組化及Masson三色染色法分析肺組織HDAC2、IL-17A及膠原表達(dá)。利用Spearman分析HDAC2、IL-17A與氣道重構(gòu)(氣管壁厚度及膠原沉積)的相關(guān)性。同時(shí),利用HDAC2、IL-17A基因敲除小鼠(HDAC2+/-,IL-17A-/-)及HDAC2/IL-17A雙基因敲除小鼠(HDAC2+/-/IL-17A-/-)構(gòu)建煙霧暴露誘導(dǎo)慢阻肺模型(100支煙/天,5天/周,連續(xù)3個(gè)月)。取右肺保存在-80℃,用于提取蛋白和mRNA,用ELISA和RT-PCR法檢測相關(guān)炎癥因子的表達(dá)。取左肺支氣管肺泡灌洗液(BALF),進(jìn)行炎癥細(xì)胞總數(shù)與分類計(jì)數(shù)。肺組織經(jīng)40%多聚甲醛固定后,制成病理切片蘇木精-伊紅染色法(HE)觀察炎癥浸潤。用過碘酸希夫反應(yīng)(PAS)、Masson三色染及免疫組化觀察氣道重構(gòu)相關(guān)指標(biāo)包括粘液分泌、膠原沉積及氣道平滑肌。分析肺組織HDAC2及IL-17A表達(dá)與氣道重構(gòu)的相關(guān)性。另一部分小鼠的雙肺,剪碎后經(jīng)膠原酶消化,研磨制成細(xì)胞懸液,經(jīng)過刺激后用流式細(xì)胞術(shù)檢測肺組織中HDAC2及IL-17A及各個(gè)T細(xì)胞亞型的變化。培養(yǎng)人支氣管上皮(HBE)細(xì)胞并予香煙提取物(CSE)、HDAC2小干擾(HDAC2 SiRNA)轉(zhuǎn)染干預(yù),利用免疫熒光及RT-PCR檢測IL-17A表達(dá)水平。取手術(shù)切除的肺組織及小鼠肺組織,分離及培養(yǎng)原代肺成纖維細(xì)胞,觀察IL-17A對成纖維細(xì)胞增殖、遷移、膠原沉積及分化的影響。結(jié)果:Spearman相關(guān)性分析顯示慢阻肺患者誘導(dǎo)痰HDAC2和IL-17A表達(dá)呈負(fù)相關(guān),且與支氣管壁增厚相關(guān)。慢阻肺患者肺組織中IL-17A表達(dá)與肺組織膠原沉積相關(guān)。香煙煙霧暴露后的HDAC2+/-小鼠的氣道炎癥浸潤、炎癥因子表達(dá)及氣道重構(gòu)明顯增加,而IL-17A-/-小鼠的氣道炎癥浸潤、炎癥因子表達(dá)及氣道重構(gòu)明顯緩解。HDAC2通過調(diào)控Th17細(xì)胞向CD4+T細(xì)胞分化及氣道上皮細(xì)胞的維甲酸相關(guān)孤兒受體γγt(RORyt)表達(dá)抑制IL-17A產(chǎn)生。在體外,IL-17A通過自分泌轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)促進(jìn)肺成纖維細(xì)胞增殖、遷移、分化及膠原沉積,參與了氣道重構(gòu)。有趣的是,在HDAC2+/-小鼠中敲除IL-17A基因(即HDAC2+/-/IL-17A-/-小鼠)可以通過抑制氣道炎癥反應(yīng)及成纖維細(xì)胞活性緩解氣道重構(gòu)。結(jié)論:HDAC2通過抑制氣道炎癥及成纖維細(xì)胞活性緩解IL-17A介導(dǎo)的氣道重構(gòu),提示HDAC2-IL17A信號通路在慢阻肺氣道重構(gòu)起著重要作用,激活HDAC2和/或抑制IL-17A表達(dá)可能對緩解慢阻肺患者氣道重構(gòu)有效。第二部分HDAC2與IL-17A相互調(diào)控哮喘氣道炎癥的分子機(jī)制研究背景及目的:HDAC2表達(dá)下降與哮喘的疾病嚴(yán)重程度相關(guān);然而,導(dǎo)致HDAC2表達(dá)下降的原因及其如何調(diào)控氣道炎癥仍然不清楚。另外,IL-17A是否參與了HDAC2表達(dá)下降導(dǎo)致的哮喘加重亦不清楚。方法:收集哮喘患者纖支鏡活檢標(biāo)本。用免疫組化檢測活檢標(biāo)本中HDAC2及IL-17A的表達(dá),分析HDAC2與IL-17A表達(dá)的相關(guān)性。同時(shí),利用HDAC2、IL-17A基因敲除小鼠(HDAC2+/-,IL-17A-/-)及HDAC2/IL-17A雙基因敲除小鼠(HDAC2+/-/IL-17A-、-)構(gòu)建屋塵螨(HDM)誘導(dǎo)的哮喘模型。取右肺保存在-80℃C,用于提取蛋白和mRNA,用ELISA和RT-PCR法檢測相關(guān)炎癥因子的表達(dá)。取左肺支氣管肺泡灌洗液(BALF),進(jìn)行炎癥細(xì)胞總數(shù)與分類計(jì)數(shù)。肺組織經(jīng)4%多聚甲醛固定后,制成病理切片蘇木精-伊紅染色法(HE)觀察炎癥浸潤。用過碘酸希夫反應(yīng)(PAS)觀察粘液分泌。另一部分小鼠的雙肺,剪碎后經(jīng)膠原酶消化,研磨制成細(xì)胞懸液,經(jīng)過刺激后用流式細(xì)胞術(shù)檢測肺組織中HDAC2及IL-17A及各個(gè)T細(xì)胞亞型的變化。培養(yǎng)人支氣管上皮(HBE)細(xì)胞并予HDM、IL-17A細(xì)胞因子、HDAC2小干擾轉(zhuǎn)染干預(yù),利用免疫熒光及RT-PCR檢測炎癥因子表達(dá)水平。結(jié)果:HDAC2在哮喘患者及小鼠肺組織中表達(dá)下降,而IL-17A表達(dá)水平明顯增加,且HDAC2與IL-17A呈負(fù)相關(guān)。HMD能導(dǎo)致小鼠肺組織及HBE細(xì)胞中HDAC2表達(dá)下降,而IL-17A表達(dá)增加。與野生型(WT)哮喘小鼠相比,HDAC2+/-小鼠的氣道炎癥及粘液分泌明顯增加,同時(shí)IL-17A的表達(dá)水平增加。相反,IL-17A-/-小鼠能緩解氣道炎癥、粘液分泌及HDAC2下降水平。HDAC2+/-小鼠中敲除IL-17A基因(即HDAC2+//IL-17A-/-小鼠)能緩解HDA2基因敲除導(dǎo)致的氣道炎癥及粘液分泌增加。HDAC2表達(dá)下降通過調(diào)控CD4+T及γδT細(xì)胞分化促進(jìn)IL-17A分泌,進(jìn)一步惡化哮喘氣道炎癥反應(yīng)。在體外,用HDM體外干預(yù)HBE細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)HDM能降低HDAC2的表達(dá),這一過程受到IL-17A的調(diào)控。利用SiRNA敲除HBE細(xì)胞的HDAC2基因后,炎癥因子如IL-6、IL-8表達(dá)明顯升高。相反,利用SiRNA敲除IL-17A基因后,上述炎癥因子表達(dá)下降。結(jié)論:HDM導(dǎo)致HDAC2表達(dá)下降,促進(jìn)了哮喘氣道炎癥反應(yīng)。HDAC2與IL-17A之間存在相互調(diào)控機(jī)制,構(gòu)成惡性循環(huán),導(dǎo)致哮喘氣道炎癥反應(yīng)及粘液高分泌,提示針對HDAC2-IL-17A信號通路靶點(diǎn)治療可能對緩解哮喘的氣道炎癥反應(yīng)及粘液分泌有效,特別是IL-17A增高的重癥哮喘患者。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R563.9;R562.25

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