本文關(guān)鍵詞：熱休克蛋白90α對(duì)靜脈淤血型皮瓣缺血再灌注損傷的實(shí)驗(yàn)研究　出處：《青島大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 熱休克蛋白90α F-5基因 靜脈淤血型皮瓣 缺血再灌注損傷

【摘要】：目的:通過(guò)建立大鼠靜脈淤血型皮瓣缺血再灌注損傷模型,對(duì)皮瓣局部注射外源性熱休克蛋白90α的功能基因“F-5”表達(dá)蛋白,觀察皮瓣血流灌注量變化、微血管新生情況及對(duì)皮瓣成活率的影響,進(jìn)而探討熱休克蛋白90α對(duì)皮瓣缺血再灌注損傷的作用機(jī)制,并為后續(xù)研究提供理論基礎(chǔ),也為該方面的臨床治療技術(shù)的轉(zhuǎn)化提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:在這項(xiàng)研究中,首先獲取外源性熱休克蛋白90α的功能基因“F-5”表達(dá)蛋白。通過(guò)基因工程技術(shù)構(gòu)建p ET15b-F-5重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21-Codon Plus(DE3)-RIPL菌株;在細(xì)菌培養(yǎng)擴(kuò)增后,挑選抗氨芐青霉素克隆進(jìn)行快速提取,用Eco R I、Bam H1雙酶切鑒定;將大腸桿菌菌種通過(guò)堿裂解法大量提取目標(biāo)質(zhì)粒;以氮川三乙酸鎳(Ni-NTA)金屬親和層析純化;通過(guò)Centricon YM-50裝置濃縮,然后用快速蛋白液相色譜法(FPLC)再次純化;用考馬斯亮藍(lán)法(Bradford法)對(duì)純化蛋白進(jìn)行定量,獲得最終濃度為1mg/ml的外源性熱休克蛋白90α“F-5”表達(dá)蛋白。其次建立軸型皮瓣的靜脈淤血型缺血再灌注損傷模型。設(shè)計(jì)以大鼠腹壁淺動(dòng)靜脈為蒂的軸型皮瓣,成功切取皮瓣后,除軸型供血血管——腹壁淺動(dòng)靜脈與供區(qū)連接外,其余組織均游離;用微型止血夾夾住腹壁淺靜脈6小時(shí)或8小時(shí)造成靜脈回流障礙,之后再通血管,出現(xiàn)再灌注損傷。將60只大鼠隨機(jī)分為三個(gè)組:A組為空白對(duì)照組,在靜脈淤血型皮瓣缺血再灌注損傷模型建立后,在血管再通即刻皮下組織層注射1ml生理鹽水;B組為熱休克蛋白90α預(yù)處理組,在靜脈阻斷前于皮瓣局部注射熱休克蛋白90α1ml(總量1mg);C組為熱休克蛋白90α治療組,在靜脈淤血型皮瓣缺血再灌注損傷模型建立后,血管再通即刻皮下組織層注射相同數(shù)量熱休克蛋白90α“F-5”基因表達(dá)蛋白。每組又分為兩個(gè)再灌注時(shí)間點(diǎn),即缺血6小時(shí)或8小時(shí)。然后在模型建立過(guò)程中采取多種方式對(duì)各組皮瓣進(jìn)行觀察,量化對(duì)比數(shù)據(jù)。用激光多普勒血流儀檢測(cè)各組皮瓣阻斷后1小時(shí)、3小時(shí)、6小時(shí)、8小時(shí)及再灌注后5分鐘、30分鐘、2小時(shí)血流灌注量,以便輔助判斷大鼠皮瓣缺血再灌注損傷的模型是否成功以及再灌注后各組皮瓣血流灌注量的恢復(fù)情況。術(shù)后每天觀察皮瓣的顏色、質(zhì)地、厚度、毛發(fā)生長(zhǎng)、毛細(xì)血管充盈試驗(yàn),針刺出血情況等;在術(shù)后第7日通過(guò)坐標(biāo)貼紙法測(cè)定三組皮瓣的成活率;在術(shù)后第1、3、7、10、14日取樣進(jìn)行蘇木素—伊紅染色及免疫組化染色,觀察皮瓣組織的病理性改變以及微血管密度計(jì)數(shù)。結(jié)果:通過(guò)Western blotting檢測(cè),SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中出現(xiàn)87KD條帶,說(shuō)明提純物為目的蛋白即熱休克蛋白90α“F-5”基因表達(dá)蛋白;通過(guò)RT-PCR及Southern blotting檢測(cè),瓊脂糖凝膠電泳中在550bp和332bp處出現(xiàn)條帶,與質(zhì)粒載體及熱休克蛋白90α“F-5”基因的m RNA分子量吻合,證明提純物為目的蛋白即“F-5”基因蛋白。血流灌注量改變:正常情況下大鼠下腹部皮瓣的血流灌注量為(397.4±26.7),在阻斷靜脈1小時(shí)后各組皮瓣的血流灌注量均明顯降低,其中空白對(duì)照組和熱休克蛋白90α治療組皮瓣血流灌注量降為正常的40%左右,阻斷6小時(shí)血流灌注量降為21%,阻斷8小時(shí)血流灌注量降為15%以下;而血流恢復(fù)后再灌注5分鐘到半小時(shí),皮瓣血流灌注量逐漸有所恢復(fù),空白對(duì)照組、熱休克蛋白90α治療組、熱休克蛋白90α預(yù)處理組恢復(fù)幅度依次增加,但同一組內(nèi)對(duì)比6小時(shí)亞組及8小時(shí)亞組,后者皮瓣的血流灌注量恢復(fù)幅度對(duì)應(yīng)有明顯下降;熱休克蛋白90α預(yù)處理組在靜脈阻斷過(guò)程中及再灌注后皮瓣的血流灌注量較空白對(duì)照組及熱休克蛋白90α治療組為高。激光多普勒血流儀測(cè)量影像也可見(jiàn)到不同組別血流灌注量的色差變化,上述變化說(shuō)明軸型皮瓣的缺血再灌注損傷模型的構(gòu)建是成功的。熱休克蛋白90α預(yù)處理組在缺血和再灌注各時(shí)間節(jié)點(diǎn)的皮瓣血流灌注量顯著高于空白對(duì)照組,也優(yōu)于熱休克蛋白90α治療組,組間對(duì)比有顯著性差異(P0.05)。大體觀察:術(shù)后第1日空白對(duì)照組皮瓣腫脹明顯,皮瓣的中遠(yuǎn)端不同程度出現(xiàn)紫紅或紫黑色,毛細(xì)血管充盈時(shí)間延長(zhǎng)或消失,伴皮紋消失,有的出現(xiàn)水泡;熱休克蛋白90α預(yù)處理組和熱休克蛋白90α治療組水腫較空白對(duì)照組輕,有毛細(xì)血管充盈現(xiàn)象,時(shí)間基本正常。術(shù)后3日空白對(duì)照組皮瓣仍有腫脹,遠(yuǎn)端壞死區(qū)域發(fā)黑,周圍伴炎性反應(yīng);熱休克蛋白90α預(yù)處理組和熱休克蛋白90α治療組皮瓣腫脹開(kāi)始消退,較空白對(duì)照組術(shù)后第4日消退為早,遠(yuǎn)端發(fā)黑區(qū)域范圍小,炎癥反應(yīng)輕。術(shù)后7日三組皮瓣壞死界限清楚,空白對(duì)照組皮瓣遠(yuǎn)端壞死部分發(fā)硬,有融痂現(xiàn)象,壞死組織部分脫落形成潰瘍;熱休克蛋白90α預(yù)處理組和熱休克蛋白90α治療組皮瓣成活范圍及營(yíng)養(yǎng)情況均較空白對(duì)照組好。術(shù)后第14日,空白對(duì)照組壞死組織黑色痂殼脫落,下面組織愈合不佳,有肉芽組織生成;熱休克蛋白90α預(yù)處理組和熱休克蛋白90α治療組皮瓣創(chuàng)緣愈合好,皮瓣柔軟、溫暖,皮瓣表面有新生毛發(fā)生成。同組內(nèi)阻斷6小時(shí)組各項(xiàng)指標(biāo)情況優(yōu)于阻斷8小時(shí)組,其中空白對(duì)照組阻斷8小時(shí)組有2例皮瓣出現(xiàn)完全壞死。皮瓣成活率:術(shù)后7日測(cè)量各組皮瓣成活率,空白對(duì)照組的平均值為(19.3±3.8)%,熱休克蛋白90α預(yù)處理組為(85.6±17.6)%,熱休克蛋白90α治療組為(78.9±20.5)%,熱休克蛋白90α預(yù)處理組皮瓣成活率最高,結(jié)果有顯著性差異(P0.05);同組內(nèi)缺血6小時(shí)亞組皮瓣成活率均高于缺血8小時(shí)亞組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。病理組織學(xué)改變:術(shù)后1、3、7、10、14日對(duì)各組皮瓣組織行HE染色進(jìn)行觀察。術(shù)后第1日,各組皮瓣組織中均可見(jiàn)到浸潤(rùn)的炎癥細(xì)胞,毛細(xì)血管擴(kuò)張明顯,血小板黏附于血管壁,伴細(xì)胞腫脹,尤其以空白對(duì)照組為著,還可觀察到微血管結(jié)構(gòu)模糊。術(shù)后3日,各組皮瓣細(xì)胞腫脹未消退,血管壁仍有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn);空白對(duì)照組可見(jiàn)血管內(nèi)血栓形成,細(xì)胞腫脹程度較熱休克蛋白90α預(yù)處理組和熱休克蛋白90α治療組明顯。術(shù)后7日,熱休克蛋白90α預(yù)處理組和熱休克蛋白90α治療組顯示皮瓣的組織結(jié)構(gòu)基本正常,皮膚的角質(zhì)層較完整,組織結(jié)構(gòu)基本正常,皮膚的角質(zhì)層較完整,血管基本保持通暢,纖維組織排布整齊,炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)減少,成纖維細(xì)胞的數(shù)量增加,毛細(xì)血管密度增加,有新的上皮組織生成;空白對(duì)照組皮瓣的組織結(jié)構(gòu)不完整,部分區(qū)域出現(xiàn)角質(zhì)層脫落,血管內(nèi)有血栓形成,血管壁附近仍有較多浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞,血管內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞增殖較少,鮮見(jiàn)新生毛細(xì)血管生成。術(shù)后10日,熱休克蛋白90α預(yù)處理組和熱休克蛋白90α治療組皮瓣組織結(jié)構(gòu)恢復(fù)正常,在邊緣壞死區(qū)域下炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少,新生毛細(xì)血管增多并伴新生組織生成;空白對(duì)照組血管壁炎性細(xì)胞數(shù)量有所減少,新生血管及新生組織不顯著。術(shù)后14日,熱休克蛋白90α預(yù)處理組和熱休克蛋白90α治療組顯示炎性細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步減少,新的毛細(xì)血管和成熟的成纖維細(xì)胞增加,細(xì)胞排列整齊,新的上皮組織增加,同時(shí)可見(jiàn)基底細(xì)胞增生;空白對(duì)照組炎性細(xì)胞數(shù)量較前進(jìn)一步減少,但局部組織新生血管少,上皮細(xì)胞增生不活躍。微血管密度計(jì)數(shù)情況:術(shù)后1、3、7、10、14日對(duì)各組皮瓣組織行免疫組化染色并對(duì)微血管密度進(jìn)行計(jì)數(shù)。發(fā)現(xiàn)術(shù)后7日各組皮瓣組織中棕色的血管內(nèi)皮細(xì)胞較前增多,其中熱休克蛋白90α預(yù)處理組和熱休克蛋白90α治療組較空白對(duì)照組增多明顯。通過(guò)微血管密度計(jì)數(shù)對(duì)比,各組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。另外,缺血6小時(shí)亞組的參數(shù)均優(yōu)于缺血8小時(shí)亞組,差異顯著(P0.05)。術(shù)后10日,熱休克蛋白90α預(yù)處理組和熱休克蛋白90α治療組傷口附近可見(jiàn)新生上皮組織,甚至可見(jiàn)清晰的新生血管。術(shù)后14日,熱休克蛋白90α預(yù)處理組和熱休克蛋白90α治療組皮瓣遠(yuǎn)端皮緣愈合良好,局部黑痂脫落,可以看到較完整的表皮和真皮結(jié)構(gòu),伴新生血管的增加。結(jié)論:通過(guò)質(zhì)粒重組、擴(kuò)增、提純等方式可以獲得有活性的外源性熱休克蛋白90α“F-5”基因表達(dá)蛋白;軸型皮瓣靜脈淤血型缺血再灌注損傷的大鼠模型的建立是可靠的,阻斷靜脈的時(shí)間控制在6小時(shí)左右為宜;外源性熱休克蛋白90α“F-5”表達(dá)蛋白可增加皮瓣血流再灌注量、降低細(xì)胞滲透,促進(jìn)新毛細(xì)血管的形成,從而提高皮瓣存活率,對(duì)靜脈淤血型皮瓣缺血再灌注損傷有較好的治療作用,而在缺血發(fā)生前使用的效果優(yōu)于缺血再灌注損傷發(fā)生后使用。
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R622

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 劉啟鋒;劉明;劉玉河;陸南;;腦缺血再灌注損傷機(jī)制研究進(jìn)展[J];中華神經(jīng)外科疾病研究雜志;2006年06期

2 王宇歆;馬濤;李鳳娟;楊成民;;缺血再灌注損傷機(jī)制及其對(duì)策的初步探討[J];中國(guó)輸血雜志;2010年S1期

3 陶平;雌激素防治缺血再灌注損傷的研究現(xiàn)狀(文獻(xiàn)綜述)[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).外科學(xué)分冊(cè);2003年05期

4 胡佳樂(lè);血管性缺血再灌注損傷的基礎(chǔ)與臨床[J];海軍醫(yī)學(xué)雜志;2003年03期

5 怡悅;續(xù)命湯預(yù)防腦缺血再灌注損傷[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(中醫(yī)中藥分冊(cè));2005年05期

6 謝明劍,薛偉新,岑家福;腦缺血再灌注損傷的中醫(yī)藥研究概況[J];華夏醫(yī)學(xué);2005年05期

7 魯力;張俐;;骨骼肌缺血再灌注損傷機(jī)制研究進(jìn)展[J];中國(guó)中醫(yī)骨傷科雜志;2005年06期

8 文靜;鐘森;董繼萍;陳麗娜;;腦缺血再灌注損傷中醫(yī)藥防治研究進(jìn)展[J];中國(guó)中醫(yī)急癥;2007年06期

9 王燕榮;愛(ài)民;謝軍;周建秀;李蘭誠(chéng);丹丹;;蒙藥防治缺血再灌注損傷的研究進(jìn)展[J];中國(guó)民族醫(yī)藥雜志;2007年08期

10 張幫健;劉進(jìn);;抗壞血酸在缺血再灌注損傷中的保護(hù)機(jī)制[J];實(shí)用醫(yī)院臨床雜志;2009年05期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 王宇歆;馬濤;李鳳娟;楊成民;;缺血再灌注損傷機(jī)制及其對(duì)策的初步探討[A];中國(guó)輸血協(xié)會(huì)第五屆輸血大會(huì)論文專集（摘要篇）[C];2010年

2 吳艷;李春英;賈旭峰;何穎;;椒苯酮胺對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用[A];中國(guó)藥理學(xué)會(huì)第十一次全國(guó)學(xué)術(shù)會(huì)議專刊[C];2011年

3 莫書榮;李德劍;;諾迪康對(duì)離體豚鼠心臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用[A];中國(guó)生理學(xué)會(huì)第五屆全國(guó)心血管、呼吸和腎臟生理學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要匯編[C];2005年

4 朱賢富;;腦缺血再灌注損傷機(jī)制的研究現(xiàn)狀[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)神經(jīng)外科學(xué)分會(huì)第九次學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2010年

5 于吉人;嚴(yán)盛;劉小孫;鄭樹(shù)森;;尿胰蛋白酶抑制劑減輕移植腸的缺血再灌注損傷[A];2004年浙江省外科學(xué)學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2004年

6 黃賢華;黃常亮;宋微微;方偉;楊芳炬;;迎春花對(duì)腦缺血再灌注損傷小鼠的保護(hù)作用[A];第十屆全國(guó)中藥藥理學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2007年

7 劉德強(qiáng);趙德化;盛寶恒;;呋喃二氫吡啶Ⅰ對(duì)離體兔心缺血再灌注損傷的保護(hù)作用[A];第二屆全國(guó)心功能學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要匯編[C];1990年

8 劉建修;;缺血再灌注損傷發(fā)生機(jī)制及防治最新進(jìn)展[A];江西省第四次中西醫(yī)結(jié)合心血管學(xué)術(shù)交流會(huì)論文集[C];2008年

9 黃唯佳;陳壽權(quán);李惠萍;程俊彥;趙初環(huán);李章平;王明山;王萬(wàn)鐵;王衛(wèi);;家兔腦缺血再灌注損傷時(shí)血栓素B_2/6-酮-前列腺素F_(1α)的變化及醒腦靜的保護(hù)作用[A];2005急診醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)研討會(huì)暨《中華急診醫(yī)學(xué)雜志》第四屆組稿會(huì)論文匯編[C];2005年

10 高立建;謝榮愛(ài);田建會(huì);;四氫生物喋呤在新西蘭兔缺血再灌注損傷中的保護(hù)作用[A];中國(guó)心臟大會(huì)（CHC）2011暨北京國(guó)際心血管病論壇論文集[C];2011年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前7條

1 衣曉峰　岳金鳳 記者　 李麗云;我科學(xué)家揭示腦缺血再灌注損傷奧秘[N];科技日?qǐng)?bào);2007年

2 衣曉峰　靳萬(wàn)慶;靜脈麻醉藥保護(hù)腦缺血再灌注損傷機(jī)制被揭示[N];中國(guó)中醫(yī)藥報(bào);2007年

3 ;抗呆I號(hào)可恢復(fù)腦缺血再灌注損傷細(xì)胞功能[N];中國(guó)中醫(yī)藥報(bào);2004年

4 張中橋;黃芪對(duì)腦缺血再灌注損傷有神經(jīng)保護(hù)作用[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2006年

5 張中橋;黃芪對(duì)腦缺血再灌注損傷有神經(jīng)保護(hù)作用[N];中國(guó)中醫(yī)藥報(bào);2006年

6 張茨;扭轉(zhuǎn)的睪丸切還是保——醫(yī)生有新說(shuō)[N];健康報(bào);2005年

7 燕海霞 王憶勤 李福鳳;川芎嗪在腎臟病中應(yīng)用前景看好[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2005年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 黃薇園;功能MRI動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)大鼠急性缺血性腦卒中缺血再灌注損傷及其與預(yù)后相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究[D];復(fù)旦大學(xué);2014年

2 王震;不同藥物干預(yù)心、腎缺血再灌注損傷的作用與機(jī)制研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2015年

3 凡進(jìn);自噬在脊髓缺血再灌注損傷過(guò)程中作用機(jī)制的研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2013年

4 楊偉;miR-208a在心肌缺血再灌注損傷中作用及相關(guān)機(jī)制的研究[D];昆明醫(yī)科大學(xué);2016年

5 姚勇剛;MG53對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2016年

6 侯帥;腦缺血再灌注損傷中線粒體縫隙連接蛋白43對(duì)神經(jīng)血管單元的保護(hù)作用及丹參多酚酸干預(yù)[D];吉林大學(xué);2016年

7 劉桂勇;右美托嘧啶對(duì)腎缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究[D];武漢大學(xué);2015年

8 邢澤剛;受體相互作用蛋白3及經(jīng)典程序性壞死信號(hào)通路在腦缺血再灌注損傷中的作用研究[D];華中科技大學(xué);2015年

9 高翔;甘氨酸—氮氧自由基綴合物對(duì)缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其內(nèi)在機(jī)制的研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2017年

10 張騁;TSGL-Ig在肝缺血再灌注損傷中的作用和機(jī)制研究[D];浙江大學(xué);2017年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 李盼;肢體缺血后適應(yīng)對(duì)缺血再灌注損傷小鼠腦保護(hù)作用及機(jī)制研究[D];河北大學(xué);2015年

2 蒲舉;遠(yuǎn)隔缺血后適應(yīng)對(duì)腦缺血再灌注損傷及相關(guān)VEGF、MMP-9表達(dá)的影響[D];遵義醫(yī)學(xué)院;2015年

3 王富明;針刺對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠外周血清SOD、MDA、miRNA-126及VEGF表達(dá)的影響[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2015年

4 趙層閃;化濁解毒活血通絡(luò)法對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠模型VEGF表達(dá)及微血管密度的影響[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

5 曲欣;解偶聯(lián)蛋白2通過(guò)線粒體介導(dǎo)參與高血糖加重腦缺血再灌注損傷的實(shí)驗(yàn)研究[D];寧夏醫(yī)科大學(xué);2015年

6 程浩;1β-羥基土木香內(nèi)酯對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用研究[D];安徽中醫(yī)藥大學(xué);2015年

7 吳建龍;p38MAPK信號(hào)通路參與雌二醇減輕皮瓣缺血再灌注損傷機(jī)制的初步研究[D];蘇州大學(xué);2015年

8 李婷婷;安菲博肽對(duì)小鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2015年

9 吳加元;Omi切割Hax-1加劇腦缺血再灌注損傷的機(jī)制研究[D];蘇州大學(xué);2015年

10 朱田豐;PDCD4在腦缺血再灌注損傷中的作用及機(jī)制研究[D];山東大學(xué);2015年

，

本文編號(hào)：1332941